转基因玉米事件LP035-1及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种核酸序列，其包含选自序列SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
转基因玉米事件LP035
‑
1及其检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及对昆虫具有抗性且耐受草甘膦和草铵膦除草剂施用的转基因玉米事件LP035
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1和用于检测转基因玉米LP035
‑
1的核酸序列及方法。

技术介绍

[0002]玉米(Zea mays L.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。生物技术已经应用于玉米以改善其农艺性状和品质。在玉米生产中昆虫抗性是一项重要的农艺性状，特别是对鳞翅目昆虫（例如小地老虎、草地贪夜蛾和甜菜夜蛾等）的抗性。玉米对鳞翅目昆虫的抗性可以通过转基因的方法使鳞翅目昆虫的抗性基因在玉米植物中表达而获得。另一个重要的农艺性状是除草剂耐受性，特别是耐受草甘膦和草铵膦除草剂。玉米对草甘膦和草铵膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草甘膦和草铵膦除草剂耐受型基因(如epsps、pat)在玉米植物中表达而获得。
[0003]除了功能基因(epsps基因和pat基因)本身，调控元件的选择及其顺序排布对于获得良好的转化事件是至关重要的，并且其技术效果是难以预料的。另外已知外源基因在植物体内的表达受其插入玉米染色体组位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。这样的转化事件具有优异的鳞翅目害虫和草甘膦、草铵膦除草剂抗性且不影响玉米产量，可采用常规育种方法通过杂交将转基因性状回交到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征和性状表现。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，具备稳定的鳞翅目害虫和草甘膦、草铵膦除草剂抗性，使这些品种免受主要鳞翅目害虫的为害，并具有广谱的杂草防控能力，同时能很好的适应当地的生长条件。
[0004]能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA（“侧翼DNA”）的序列是己知的，否则上述这种方法不能用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的T
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DNA和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含
NO:4和SEQ ID NO:5中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是大约17个到50个或更多的连续核苷酸。所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因玉米事件LP035
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1中在插入序列的5
’
末端位于插入接合部位附近的一个长度为903个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由449个核苷酸的玉米侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1
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449)、384个核苷酸的pLP035构建体DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸450
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833)和70个核苷酸的35s终止子的3
’
末端DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸834
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903)组成，包含所述SEQ IDNO:3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件LP035
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1的存在。
[0010]所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中3
’
侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或者更多个连续核苷酸（第四核酸序列）。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:2的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件LP035
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1或其后代的存在。所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因玉米事件LP035
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1中在插入序列的3
’
末端位于插入接合部位附近的一个长度为1130个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4或其互补序列由157个核苷酸的35s（花椰菜花叶病毒35s）转录终止子序列(SEQ ID NO:4的核苷酸1
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157)、202个核苷酸的pLP035构建体DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸158
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359)和771个核苷酸的玉米整合位点侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸360
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1130)组成，包含所述SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件LP035
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1的存在。
[0011]所述SEQ ID NO:5或其互补序列为表征转基因玉米事件LP035
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1的长度为11579个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO:5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件LP035
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1的存在。
[0012]表1、SEQ ID NO:5包含的基因组及遗传元件
[0013]遗传元件长度位于SEQIDNO:5上的位置5
’
基因组449bp1
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449RB384bp450
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833t35s70bp834
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903iPEPC108bp906
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1013Vip3Aa
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m12370bp1032
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3401iZmHSP70812bp3410
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4221p35s322bp4222
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4543pOsAct11411bp4549
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5959spAtCTP2228bp59本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸序列，其特征在于，包含选自序列SEQ ID NO:1
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7或其互补序列中的一种或多种，所述核酸序列来源于转基因玉米事件LP035
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1，所述转基因玉米事件LP035
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1的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO: P202321保藏于中国典型培养物保藏中心。2.一种DNA引物对，包含第一引物和第二引物，其特征在于，所述第一引物和所述第二引物各自包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，且当与含有玉米事件LP035
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1的DNA一起用于扩增反应时，产生检测样品中玉米事件LP035
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1的扩增子。3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述第一引物选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12；所述第二引物选自SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:14。4.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述第一引物选自SEQIDNO:1或其互补序列、SEQIDNO:8或SEQ ID NO:12，所述第二引物选自SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13；或者所述第一引物选自SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15，所述第二引物选自SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14。5.一种DNA探针，其特征在于，包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，所述DNA探针在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交。6.根据权利要求5所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针包含选自SEQ ID NO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列的序列。7.根据权利要求5所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针包含选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列和SEQ ID NO:7或其互补序列的序列。8.一种标记物核酸分子，其特征在于，包含SEQ ID NO:5的部分序列或其互补序列，所述标记物核酸分子在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交，并在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO:1
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7或其互补序列的核酸序列的DNA分子杂交。9.根据权利要求8所述的标记物核酸分子，其特征在于，所述标记物核酸分子包含选自SEQ ID NO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列的序列。10.根据权利要求8所述的标记物核酸分子，其特征在于，所述标记物核酸分子包含选自SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列和SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅方明，郭贺鹏，邸萌亮，王强，李晨光，孙宇，赵丽媛，
申请(专利权)人：隆平生物技术海南有限公司，
类型：发明
国别省市：