生产重组腺相关病毒颗粒的方法技术

本文提供了用于生产重组病毒颗粒的改进方法。在一些实施方案中，本文所述的用于生产重组病毒颗粒的方法包括：提供包含能够生产病毒颗粒的细胞群的悬浮细胞培养物，将第一体积的多核苷酸：转染试剂复合物转移至悬浮培养物以转染细胞，以及将第二体积的多核苷酸：转染试剂复合物转移至悬浮培养物，其中第一和第二体积的多核苷酸：转染试剂复合物的转移同时或以任何顺序依次进行。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。病毒颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产重组腺相关病毒颗粒的方法


[0001]本公开涉及一种在大规模悬浮细胞培养物中生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括转染培养物中的细胞。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2020年12月16日提交的美国申请号63/126,405的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

技术介绍

[0004]基于重组腺相关病毒(AAV)的载体目前是开发中的使用最广泛的基因治疗产品。rAAV载体系统的优选用途部分是由于缺乏与野生型病毒相关联的疾病、AAV转导非分裂细胞和分裂细胞的能力以及在临床试验中观察到的所得的长期稳健的转基因表达，并且表明在基因疗法适应症中具有巨大的递送潜力。此外，不同的天然存在和重组rAAV载体血清型特异性地靶向不同的组织、器官和细胞，并帮助逃避对所述载体的任何预先存在的免疫，从而扩大基于AAV的基因疗法的治疗性应用。在复制缺陷型病毒例如基于AAV的基因疗法可以更广泛地用于后期临床阶段和商业用途之前，需要开发大规模生产重组病毒颗粒的新方法。
[0005]因此，本领域需要提高用于大规模生产rAAV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产重组病毒颗粒的方法，所述方法包括a)提供约200升与约20，000升之间的悬浮细胞培养物，其包含能够生产所述重组病毒颗粒的细胞群；b)将一种或多种多核苷酸与至少一种转染试剂混合以形成第一混合物，孵育所述混合物以形成多核苷酸：转染试剂复合物，并将所述多核苷酸：转染试剂复合物转移至所述悬浮培养物以转染所述细胞；c)将所述一种或多种多核苷酸与所述至少一种转染试剂混合以形成第二混合物，孵育所述混合物以形成多核苷酸：转染试剂复合物，并将所述多核苷酸：转染试剂复合物转移至所述悬浮培养物以转染所述细胞；以及d)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下，其中(i)所述一种或多种多核苷酸含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因；(ii)步骤b)和步骤c)的混合、孵育和转移各自在少于约60分钟内完成；(iii)步骤b)和步骤c)中的转移在不长于约6小时的时间段内进行；并且(iv)步骤b)和步骤c)的转移同时或以任何顺序依次进行。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤c)再重复一次。3.如权利要求1所述的方法，其中步骤c)重复一次或多次。4.如权利要求1所述的方法，其中步骤c)重复1、2、3、4、5、6、7或8次。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中转移至所述悬浮培养物的所述多核苷酸：转染试剂复合物的组合体积为步骤a)的所述悬浮细胞培养物的体积的约5％与约20％之间。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤c)的转移在完成步骤b)的转移之后约5分钟与约60分钟之间开始。7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤c)的转移在完成步骤b)的转移之后不超过约60分钟开始。8.一种增加重组病毒颗粒的生产的方法，所述方法包括a)提供约200升与约20，000升之间的悬浮细胞培养物，其包含能够生产所述重组病毒颗粒的细胞群；b)将一种或多种多核苷酸与至少一种转染试剂混合以形成第一混合物，孵育所述混合物以形成多核苷酸：转染试剂复合物，并将所述多核苷酸：转染试剂复合物转移至所述悬浮培养物以转染所述细胞；c)将所述一种或多种多核苷酸与所述至少一种转染试剂混合以形成第二混合物，孵育所述混合物以形成多核苷酸：转染试剂复合物，并将所述多核苷酸：转染试剂复合物转移至所述悬浮培养物以转染所述细胞；以及d)将包含所述转染细胞的所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下，其中(i)所述一种或多种多核苷酸含有生产所述重组病毒颗粒所必需的基因；
(ii)步骤b)和步骤c)的混合、孵育和转移各自在少于约60分钟内完成；(iii)步骤b)和步骤c)中的转移在不长于约6小时的时间段内进行；并且(iv)步骤b)和步骤c)的转移同时或以任何顺序依次进行。9.如权利要求8所述的方法，其中步骤c)再重复一次。10.如权利要求8所述的方法，其中步骤c)重复一次或多次。11.如权利要求8所述的方法，其中步骤c)重复1、2、3、4、5、6、7或8次。12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中转移至所述悬浮培养物的所述多核苷酸：转染试剂复合物的组合体积为步骤a)的所述悬浮细胞培养物的体积的约5％与约20％之间。13.如权利要求8至12中任一项所述的方法，其中步骤c)的转移在完成步骤b)的转移之后约5分钟与约60分钟之间开始。14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，其中步骤c)的转移在完成步骤b)的转移之后不超过约60分钟开始。15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述将一种或多种多核苷酸与至少一种转染试剂混合是通过内联混合器进行的。16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)和步骤c)的混合、孵育和转移各自在少于约30分钟内完成。17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)和步骤c)的混合、孵育和转移各自在少于约35分钟内完成。18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)和步骤c)的孵育各自持续约10至约20分钟。19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)和步骤c)的孵育各自持续约10至约15分钟。20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种转染试剂包含稳定的阳离子聚合物。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种转染试剂包含PEI。22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约200升与约5,000升之间的体积。23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约200升与约2,000升之间的体积。24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约200升与约1,000升之间的体积。25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约200升与约500升之间的体积。26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约200升、约300升、约400升、约500升、约750升、约1,000升、约2,000升、约3,000升、或约5,000升的体积。27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约500升的体积。28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约1,000升的体积。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物具有约2,000升的体积。30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群包括哺乳动物细胞群或昆虫细胞群。31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群包括哺乳动物细胞群。32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群包括HEK293细胞群、HEK衍生细胞群、CHO细胞群、CHO衍生细胞群、HeLa细胞群、SF
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9细胞群、BHK细胞群、Vero细胞群和/或PerC6细胞群。33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群包括HEK293细胞群。34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)中提供的所述悬浮细胞培养物包含约2x10E+6与约10E+7之间的活细胞/ml。35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞培养物保持在允许生产所述重组病毒颗粒的条件下约2天与约10天之间、约3天与约5天之间、或约5天与14天之间。36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。37.如前述权利要求中...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：再生生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：