一种质粒组合物、大鼠水动力肝癌模型的构建方法及应用技术

本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种质粒组合物、大鼠水动力肝癌模型的构建方法及应用。本申请的大鼠肝癌模型可通过多种不同质粒组合，广泛覆盖目前已知常见的肝癌发生驱动基因，最大程度模拟临床肝癌患者分子特征；对比传统化学诱导大鼠肝癌模型，本申请的技术方案肿瘤驱动因素单一，成瘤快，成瘤率高，观察及干预时间窗合适，可进行生物发光活体成像实时定量追踪肿瘤生长及治疗情况；并且，本申请的技术方案造模简便，且为肝原发肿瘤，克服免疫排斥问题，肿瘤不出现自限性生长，肿瘤生物学特征更接近人体肝癌特征。特征更接近人体肝癌特征。特征更接近人体肝癌特征。

【技术实现步骤摘要】
一种质粒组合物、大鼠水动力肝癌模型的构建方法及应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其是涉及一种质粒组合物、大鼠水动力肝癌模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌是常见恶性肿瘤，其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，以下简称肝癌)占约85％～90％。肝癌治疗策略主要是根据不同临床分期进行多学科综合治疗，其中早期以病灶局部手术切除、局灶肿瘤消融或肝移植等根治性治疗为主，中晚期肝癌以肝局部治疗(如肝动脉化疗栓塞、肝动脉灌注化疗、立体定向放疗)联合系统治疗(如靶向治疗、免疫治疗)为主。但无论局部治疗还是系统治疗，肝癌总体治疗反应率低，复发率高，易产生治疗抵抗。为阐明各种肝癌治疗方案的技术特征、关键机制，寻找潜在生物标志物，开发新治疗靶点，目前亟需完善肝癌的动物实验平台。
[0003]已开发的小鼠肝癌模型种类相对齐全，主要有诱发性肝癌模型(包括毒物、药物、风险因子)，移植瘤肝癌模型(包括同种或异种移植瘤模型)，基因工程肝癌模型(包括水动力肝癌模型，转基因肝癌模型)，而目前大鼠肝癌模型尚不完备。已成熟使用的仅有毒物诱发性肝癌模型和细胞源性同种移植瘤模型。其余有关兔、土拨鼠、猪等大动物肝癌模型文献较少报道。
[0004]然而现有大、小鼠肝癌模型在肝肿瘤局部治疗研究中存在以下困境：1、小鼠肝癌模型无法满足对局部操作要求高的治疗需求。正常成年小鼠肝脏重量一般不超过2.0g，肝肿瘤体积过小，难以用于动物实验所需的大型外科手术、影像学定位下的局部消融或放疗、精细的血管介入术(肝动脉化疗栓塞、肝动脉灌注化疗)等对局部解剖要求颇高的操作。2、大鼠是理想的肝癌局部干预模式动物，但现有大鼠肝癌模型存在诸多制约因素。大、小鼠基因组编码基因和人类相似度均为85％，而大鼠具有体型大(是小鼠体型10倍以上)、易获取、饲养简单、生命力顽强的特点。正常大鼠免疫监视功能强大，肝癌自然发生率极低。目前针对免疫正常大鼠的肝癌模型中，广泛应用的是化学药物诱导的大鼠肝癌模型，但其造模周期极长(数月至一年余)，所成肿瘤基因特征与人类肝癌基因背景差异大，且成瘤后大鼠一般状况差，后续治疗研究困难，目前仅用于肝癌的起始发生及肿瘤预防研究。而大鼠的细胞同种异体移植瘤模型操作繁杂，造模创伤大，每种肿瘤细胞模型代表性有限，且因宿主免疫排斥问题导致成瘤率低，不加以免疫抑制措施易出现肿瘤自限性回缩，无法模拟原发肝癌生物学行为，因此使用范围相对有限。
[0005]因此，亟需构建一种操作简单、造模周期短、成瘤率高、基因背景与人类肝癌相近的大鼠原位肝癌模型。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种质粒组合物、大鼠水动力肝癌模型的构建方法及应用。
[0007]为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
[0008]第一目的，本申请提供了一种质粒组合物，所述质粒组合物包括转座子质粒和转座酶质粒；
[0009]所述转座子质粒包括在基础质粒的MYC阅读框下游的酶切位点插入P2A
‑
Emx1序列形成；所述转座酶质粒编码的睡美人转座酶识别转座子质粒的反向重复序列，所述转座酶质粒编码的睡美人转座酶结合转座子质粒的反向重复序列，所述转座子质粒中的转座子序列位于所述两段反向重复序列之间。
[0010]本申请的专利技术人经过大量的实验研究发现，本申请获得上述能实现大鼠水动力肝癌模型的质粒组合物，寻找到与原癌基因MYC强效协同的协癌基因EMX1，当大鼠水动力肝癌造模中，引入上述质粒组合物可以促进肝癌细胞的增长，实现由原癌基因MYC和协癌基因EMX1驱动的肝脏肿瘤发生，成瘤率较高。
[0011]优选地，转座酶质粒以剪切/粘贴的方式将转座子质粒中的转座子序列转座入大鼠肝细胞基因组的TA二核苷酸位点，以实现大鼠肝细胞中由同一真核生物启动子调控下的原癌基因MYC，协癌基因EMX1过表达。
[0012]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述转座子序列具有与SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列至少98％的同一性。
[0013]当转座子序列为上述序列时，可实现MYC蛋白和Emx1蛋白等量表达，起到高效协同致癌作用。
[0014]本申请的Emx1来源人或鼠，人类EMX1基因(ID：2016)，小鼠Emx1基因(ID：13796)，大鼠Emx1基因(ID：500235)主要的注释转录本编码序列长度均为774bp，三者序列同源性达96.5％，编码蛋白长度均为258个氨基酸，序列同源性高达98.4％，是一个进化过程中高度保守的基因。实验证明人与鼠的EMX1蛋白具有相同的协同MYC效应。
[0015]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述基础质粒包括addgene质粒。优选地，基础质粒包括addgene质粒pT3
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EFIA
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MYC
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IRES
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Luciferase，其为转座子质粒最为接近的开源的质粒。
[0016]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述反向重复序列的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，所述反向重复序列互补的反向序列的核苷酸序列如SEQ IDNo:3所示。
[0017]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述睡美人转座酶包括SB10，SB11，SB13，SB32，SB100睡美人转座酶中的至少一种，优选地，所述睡美人转座酶为SB100转座酶。
[0018]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，转座子质粒与所述睡美人转座酶的质量浓度比为5～20:1，浓度不同会轻度影响转座效率；体系中总的质粒浓度约10
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50μg/ml，浓度不同会显著影响转化效率及造模动物死亡率。
[0019]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述酶切位点包括PspXI酶切位点。
[0020]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述转座子质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，所述转座酶质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。采用上述的转座子质粒和转座酶质粒可以更好地提高大鼠水动力肝癌模型的成瘤率。
[0021]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述质粒组合物还包括拓展质粒，所述拓展质粒包括过表达原癌基因质粒/突变体质粒或者基于CRISPR系统的抑癌基因敲除质粒。
[0022]本申请的质粒组合物在转座子质粒和转座酶质粒的基础上引入拓展质粒，可以进一步提高大鼠水动力肝癌模型的成瘤率，拓展质粒可在转座子质粒和转座酶质粒的基础上进行质粒工具库的扩展，通过不同的搭配组合构建大鼠水动力肝癌库。
[0023]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述原癌基因包括Ctnnb1、Nras、Akt1、Pik3ca中的至少一种；所述抑癌基因包括Tp53、Pten、Rb1中的至少一种。
[0024]作为本申请所述质粒组合物的优选实施方式，所述过表达原癌基因质粒/突变体质粒包括pT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种质粒组合物，其特征在于，所述质粒组合物包括转座子质粒和转座酶质粒；所述转座子质粒包括在基础质粒的MYC阅读框下游的酶切位点插入P2A
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Emx1序列形成；所述转座酶质粒编码的睡美人转座酶识别转座子质粒的反向重复序列，所述转座酶质粒编码的睡美人转座酶结合转座子质粒的反向重复序列，所述转座子质粒中的转座子序列位于所述两段反向重复序列之间。2.如权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于，所述转座子序列具有与SEQ ID No:1所示的核苷酸序列至少98％的同一性。3.如权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于，所述基础质粒包括addgene质粒。4.如权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于，所述反向重复序列的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，所述反向重复序列互补的反向序列的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。5.如权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于，所述睡美人转座酶包括SB10，SB11，SB13，SB32，SB100睡美人转座酶中的至少一种，优选地，所述睡美人转座酶为SB100转座酶。6.如权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于，所述酶切位点包括PspXI酶切位点。7.如权利要求6所述的质粒组合物，其特征在于，所述转座子质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，所述转座酶质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。8.如权利要求1所述的质粒组合物，其特征在于，所述质粒组合物还包括拓展质粒，所述拓展质粒包括过表达原癌基因质粒/突变体质粒或者基于CRISPR系统的抑癌基因敲除质粒。9.如权利要求8所述的质粒组合物，其特征在于，所述原癌基因包括Ctnnb1、Nras、Akt1、Pik3ca中的至少一种；所述抑癌基因包括Tp53、Pten、Rb1中的至少一种。10.如权利要求8...

【专利技术属性】
技术研发人员：温东升，简沛恩，石明，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：