一种抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体及其应用。所述纳米抗体的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列，所述纳米抗体的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的序列，所述纳米抗体的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的序列。本发明专利技术的抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体可特异性的结合鸟苷酸环化酶2C抗原，且亲和力较好，将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体和CAR

【技术实现步骤摘要】
and its ligand Escherichia coli heat
‑
stable enterotoxin as a potential protein
‑
delivering vehicle for colorectal cancer cells.Eur J Cancer,2005,41(11):1618
‑
1627,doi:10.1016/j.ejca.2005.02.031.)。
[0006]GUCY2C起初被称为STa受体，早前被确定为导致旅行者腹泻致病菌的热稳定肠毒素(STa)的受体。初期的研究表明，STa由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)分泌，与其他致泻毒素(如霍乱毒素)相比，STa可导致肠道的环GMP(cGMP)积累。这表明，STa信号激活可能通过鸟苷酸环化酶，而鸟苷酸环化酶是已知的催化GTP转化为cGMP和焦磷酸的蛋白质家族成员之一，利用鸟苷酸环化酶催化结构域高度保守的序列，首次从大鼠小肠cDNA文库中克隆出GUCY2C，并证明它既是STa受体，也是cGMP积累的来源。GUCY2C在所有脊椎动物中都较为保守，而GUCY2C的突变是其对分泌的影响，其功能丧失可导致分泌减少和新生儿肠梗阻，而GUCY2C功能获得将导致分泌增加和分泌性腹泻。
[0007]目前最新研究表明GUCY2C可能是治疗胃肠道癌症的一个极有潜力的免疫治疗靶点。早在2008年，就有利用靶向GUCY2C制成疫苗的免疫治疗方法，研究者选择GUCY2C的胞外结构域作为疫苗靶点，克隆到重组腺病毒血清型5(Ad5)中，用于免疫原性和结直肠癌治疗研究，与对照组相比，Ad5
‑
GUCY2C显著降低了肝和肺转移(结直肠癌转移最常见的两个部位)小鼠模型的肿瘤负担，并增加了小鼠的存活率。(参见：John C Flickinger Jr,Jeffrey A Rappaport,Joshua R Barton,et al.Guanylyl cyclase C as a biomarker for immunotherapies for the treatment of gastrointestinal malignancies.Biomark.Med.(2021)15(3),201
–
217.)。
[0008]Michael S.Magee等人利用人类特异的GUCY2C单链可变片段，构建靶向人类GUCY2C表达转移瘤的CART细胞，促进抗原依赖性T细胞的激活，并且可以使激活标记物上调和细胞因子产生，并杀死GUCY2C表达的肿瘤细胞。在同源移植小鼠模型，针对GUCY2C的CAR
‑
T细胞可以对表达人GUCY2C的小鼠结直肠癌细胞的肺转移模型具有长期的保护作用。其次在免疫缺陷小鼠的人异种移植模型中，针对GUCY2C的CAR
‑
T细胞识别并杀死内源性表达GUCY2C的人结直肠癌细胞，从而提供了模型持久的生存期。研究人员利用编码对人类GUCY2C具有特异性的scFv的CAR设计，在结直肠肺转移模型中，剂量研究表明，单次注射最高剂量的107个CAR T细胞，有60％的动物可以治愈。并以这个剂量重复注射CAR
‑
T细胞，在肿瘤移植后100天，治疗的存活率提高到80％。此外，75％的最初用GUCY2C CAR
‑
T细胞治疗的动物在肿瘤再次移植后存活了超过80天，这表明GUCY2C CART细胞在初次用药后的6个月内仍能持续存在并发挥作用。此外，在腹膜转移的CDX模型中，使用人类结直肠癌细胞系T84进行成瘤实验，构建的人类GUCY2C的CAR
‑
T细胞对100％的测试动物都有治愈作用。上述情况有力地支持了GUCY2C导向的CAR
‑
T细胞疗法在胃肠道恶性肿瘤的临床应用中具有极其潜在的价值。(Magee MS,Abraham TS,Baybutt TR,et al.Human GUCY2C
‑
targeted chimeric antigen receptor(CAR)
‑
expressing T cells eliminate colorectal cancer metastases.Cancer Immunol.Res.6(5),509
–
516(2018).)。
[0009]综上所述，GUCY2C可作为肿瘤治疗的靶点，提供一种具备高特异性和亲和力的抗GUCY2C抗体，对于治疗恶性肿瘤具有重要意义。

技术实现思路

[0010]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体及其应用，本专利技术的抗GUCY2C的纳米抗体具有高亲和力，能够作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域制备CAR
‑
T细胞，所得CAR
‑
T细胞在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景。
[0011]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]第一方面，本专利技术提供一种抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体，所述纳米抗体的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的序列，所述纳米抗体的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的序列，所述纳米抗体的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示的序列。
[0013]本专利技术中，以鸟苷酸环化酶2C重组蛋白免疫一只未经免疫的羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，根据该噬菌体展示纳米抗体库对抗鸟苷酸环化酶2C抗体进行筛选，得到可特异性的结合鸟苷酸环化酶2C抗原的单克隆抗体，所述抗体属于单域抗体。
[0014]本专利技术提供的抗GUCY2C的纳米抗体具有高亲和力，能够作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域制备CAR
‑
T细胞，所得CAR
‑
T细胞在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景。
[0015]SEQ ID NO.1：GYTYSSYC。
[0016]SEQ ID NO.2：GINYRNYC。
[0017]SEQ ID NO.3：GYTRGTHA。
[0018]SEQ ID NO.4：IDSDGST。
[0019]SEQ ID NO.5：IYNGD。
[0020]SEQ ID NO.6：IYNGA。
[0021]SEQ ID NO.7：IYNAA。
[0022]SEQ ID NO.8：SYNGD。
[0023]SEQ ID NO.9：VETDGNT。
[0024]SEQ ID NO.10：MYNGD。
[0025]SEQ ID NO.11：AADGPGRCYGGYWYRSPKISFGI。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列；所述纳米抗体的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的序列；所述纳米抗体的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示的序列。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1所述的抗鸟苷酸环化酶2C的的纳米抗体的编码基因。3.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括权利要求1所述的抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽包括CD8α信号肽；优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区；优选地，所述跨膜区包括CD8α跨膜区、CD28跨膜区或DAP10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序；优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4
‑
1BB、CD28胞内区、OX40、ICOS或DAP10胞内区中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、权利要求1所述的抗鸟苷酸环化酶2C的纳米抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求3或4所述的嵌合抗原受体的编码基因；优选地，所述表达载体为含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：余学军，狄升蒙，范艳秋，李照润，马恒，赵佐瞬，周奚，陈鑫，冯冬歌，
申请(专利权)人：华道上海生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：