针对人AXL的兔单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供针对人AXL的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供针对人受体酪氨酸激酶AXL的高亲和力兔单克隆抗体对，并利用该兔单克隆抗体对开发出双抗夹心ELISA检测方法，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点。稳定性好等优点。稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
针对人AXL的兔单克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及免疫检测
，具体涉及一种针对人受体酪氨酸激酶AXL的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]AXL是受体酪氨酸激酶TAM家族成员之一，可将细胞外基质的信号转导至细胞质，并调节许多生理过程，在癌细胞的增殖、入侵、迁移、上皮间质细胞转化(EMT)、维持干细胞特性、肿瘤血管生成以及肿瘤微环境中的免疫调节起到重要作用。
[0003]GAS6
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AXL信号通路在促进肿瘤生长及转移、肿瘤免疫逃逸与药物耐受中的关键作用，在肿瘤的进展和恶性化过程中扮演重要角色，可以作为生物标志物进行肿瘤的临床诊断；AXL及其配体GAS6在许多恶性肿瘤中均高表达，如急性髓系白血病、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等。AXL与GAS6结合后，能激活多条通路，并参与肿瘤发生发展的多个过程。AXL同样表达于多种免疫细胞，主要介导凋亡细胞的清除和固有免疫反应的调节，其下游信号通路的激活，特别是抗原递逞细胞上，AXL的活化，能够抑制如I型干扰素和TNFα等炎性细胞因子的分泌。
[0004]同时作为一个重要的药物靶点，靶向AXL
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Gas6信号通路的先导药物主要包括：AXL的小分子抑制剂、AXL的核酸适配体、AXL治疗性抗体以及AXL诱饵蛋白，而进入临床研究的大多数为AXL小分子抑制剂如BGB324、SKI
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606、Foretinib、LY2801653和MP
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470等。/>[0005]通过测定人体体液和血浆中的AXL水平，可以对癌症及癌症治疗预后做出诊断评估。在正常人的血清中，AXL蛋白水平较低，其浓度范围在21～55μg/mL，在唾液中的浓度范围是100pg/mL左右，因此开发一种高灵敏度的AXL蛋白检测方法学，具有非常重要的临床意义。
[0006]另外，常规ELISA检测试剂盒均采用鼠抗人AXL单克隆抗体，其与人AXL的亲和力和特异性普遍较低。

技术实现思路

[0007]基于此，有必要提供针对人受体酪氨酸激酶AXL的兔单克隆抗体及其应用，具体提供兔单克隆抗体对A和B，与人受体酪氨酸激酶AXL的亲和力高，利用该高亲和力兔单克隆抗体所建立的双抗夹心法ELISA检测方法的灵敏度高，特异性强。
[0008]本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提针对人AXL的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B，分别结合人AXL表面的不同抗原决定簇。
[0010]其中，所述兔单克隆抗体A的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；所述兔单克隆抗体A的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示。所述兔单克隆抗体A的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示，重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]所述兔单克隆抗体B的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。所述兔单克隆抗体B的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。所述兔单克隆抗体B的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，重链的全长序列如SEQ ID NO.16所示。
[0012]本专利技术还可以提供编码上述针对人AXL的兔单克隆抗体的基因序列，或者包含该基因序列的表达载体或者宿主。
[0013]本专利技术还可以提供一种标记抗体偶联物，主要由上述针对人AXL的兔单克隆抗体与荧光标记分子反应制备而成。
[0014]本专利技术提供针对人AXL的高亲和力兔单克隆抗体对在建立高灵敏度的人AXL的酶联免疫检测方法中的应用。所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为兔单克隆抗体A，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体B。
[0015]本专利技术还可以提供一种检测人AXL的试剂或者试剂盒，包含针对人AXL的兔单克隆抗体A和B。所述人AXL包括重组表达的人AXL，或细胞分泌的人AXL，或人血清中的人AXL。
[0016]本专利技术还可以提供针对人AXL兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将针对人AXL的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染工程细胞；培养获得包含兔单克隆抗体对A和B的上清液；纯化，即得。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0018]本专利技术用来制备人AXL兔单克隆抗体的免疫原是利用哺乳表达系统在体外重组表达的、经验证具有生物活性的人AXL截短蛋白；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。
[0019]本专利技术成功开发了高亲和力的抗人AXL兔单克隆抗体A和B，兔单克隆抗体A和重组表达人AXL结合的亲和常数为5.55
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，兔单克隆抗体B和重组表达人AXL结合的亲和常数为1.14
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‑9。本专利技术还证明上述两种抗体可以识别人AXL表面的不同抗原决定簇，开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒；利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点，检测灵敏度为0.11ng/mL。该方法学的建立，提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人AXL的试剂盒，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。
附图说明
[0020]图1为构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图。
[0021]图2为构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图。
[0022]图3为针对人AXL蛋白的兔单克隆抗体A和B纯化检测结果图。
[0023]图4为针对人AXL蛋白的兔单克隆抗体A和B的亲和力测定结果图。
[0024]图5为针对人AXL蛋白的兔单克隆抗体A和B的抗原决定簇测定结果图。
[0025]图6为本专利技术实施例2中使用兔单克隆抗体A与兔单克隆抗体B对重组人AXL进行双抗夹心酶联免疫检测的结果图。
具体实施方式
[0026]本专利技术的技术构思在于提供一种针对人受体酪氨酸激酶AXL的兔单克隆抗体对及其制备方法和应用。开发的兔单克隆抗体对(兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B)与人受体酪氨酸激酶AXL的亲和力高，利用该高亲和力兔单克隆抗体对所建立的双抗夹心法ELISA检测方法的灵敏度高，特异性强，便于适用于血清、细胞培养基样品中极微量水平的AXL检测。
[0027]其中，兔单克隆抗体A的轻链的氨基酸全长序列为：
[0028]MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对人AXL的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B，分别结合人AXL表面的不同抗原决定簇；所述兔单克隆抗体A的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；所述兔单克隆抗体B的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。2.根据权利要求1所述的针对人AXL的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体A的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO.7所示；所述兔单克隆抗体B的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.12所示，和/或重链可变区的序列如SEQ ID NO.17所示。3.根据权利要求2所述的针对人AXL的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体A的轻链的全长序列如SEQ ID NO.1所示，和/或重链的全长序列如SEQ ID NO.6所示；所述兔单克隆抗体B的轻链的全长序列如SEQ ID NO.11所示，和/或重链的全...

【专利技术属性】
技术研发人员：代海艳，吴海，吴琬昕，贤加欢，娄阳，程昊，汤欢欢，刘政泽，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：