用于预防或治疗癌症的特异性T细胞及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于预防或治疗癌症的基于外周血或外周免疫器官的癌症特异性T细胞的制备方法，具体包括如下步骤：先分离得到外周血或者外周免疫器官的免疫细胞，然后与负载癌症全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子共孵育一段时间激活癌症特异性T细胞，尔后分离得到被癌症抗原激活的癌症特异性T细胞，经过体外扩增后回输机体内发挥抗癌作用。本发明专利技术制备得到的纳米粒子或微米粒子，将肿瘤抗原组分负载在微米粒子和/或纳米粒子，用于激活癌症特异性T细胞，然后经过扩增后回输患者用于癌症的治疗或者预防复发或转移。分选法分离得到的癌症特异性T细胞特异性高，经扩增后杀伤癌细胞效果即可预防或治疗癌症。效果即可预防或治疗癌症。效果即可预防或治疗癌症。

【技术实现步骤摘要】
用于预防或治疗癌症的特异性T细胞及其制备方法


[0001]本专利技术涉及免疫治疗
，尤其涉及一种用于预防或治疗癌症的特异性T细胞及其制备方法和其应用。

技术介绍

[0002]免疫细胞(immune cell)是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括先天性淋巴细胞、各种吞噬细胞以及能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等，如T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。自身免疫细胞治疗剂是通过从自身血液中分离和培养免疫细胞而用于抗肿瘤。通过补充高活性的免疫细胞，增加了体内免疫细胞的数量，同时激活了体内原有的免疫细胞，从而大幅提升了免疫细胞杀灭肿瘤细胞、细菌、病毒等的能力，达到防癌抗癌的目的。
[0003]在本申请专利技术团队的在先申请CN202011027741.0中，公开了一种检测方法，该检测方法可检测用患者肿瘤组分负载的纳米粒子激活的T细胞。但该申请为检测方法而非治疗方法，未对激活的T细胞进行分选、扩增，也未涉及回输步骤，在检测过程中需要对T细胞进行固定染色，未能提供相应的活性T细胞。因此，通过肿瘤抗原负载纳米粒子从而激活、富集特定类型的T细胞从而发挥肿瘤治疗效果未见现有技术报道。
[0004]由于癌症患者尤其是身体机能状态较差的癌症患者体内的癌症特异性T细胞数量较少且活性较低，其癌症特异性T细胞存在活化困难、扩增慢、培养周期长、细胞活率低等影响抗肿瘤免疫治疗的问题。本专利技术将识别癌细胞和杀伤癌细胞功能的癌症特异性T细胞经过体外肿瘤抗原的进一步刺激，再经分选分离、大规模扩增后回输给患者使用，实现了通过回输癌症特异性T细胞用于预防癌症发生、预防癌症转移和治疗癌症的有效方法。
[0005]中国专利申请(202011027741.0)所公开的纳米粒子激活肿瘤特异性T细胞等
技术实现思路
作为本专利技术必不可少的组成部分。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种来源于自体或同种异体的用于预防或治疗癌症的癌症特异性T细胞的制备方法，具体包括如下步骤：先分离得到外周血或者外周免疫器官的免疫细胞，然后与抗原提呈细胞(Antigen
‑
presenting cells,APC)以及负载癌症全细胞组分或含全细胞部分抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子共孵育一段时间激活癌症特异性T细胞，尔后分离得到被癌症抗原激活的癌症特异性T细胞，经过体外扩增后回输机体内发挥抗癌作用。
[0007]本专利技术优选的技术方案中，所述制备方法具体包括如下步骤：
[0008](1)先分离得到外周血或者外周免疫器官的免疫细胞，或从所述免疫细胞中分选得到T细胞；
[0009](2)将负载有肿瘤抗原组分的微米粒子和/或纳米粒子与抗原提呈细胞以及T细胞混合后共孵育，分选出被激活并表达特定细胞标志物的T细胞；
[0010](3)将步骤(2)分选得到的表达特定细胞标志物的T细胞与细胞因子和/或抗体共孵育，获得扩增后的特异性T细胞；
[0011]优选地，步骤(2)中，所述肿瘤抗原组分可以为肿瘤组织/癌细胞的全细胞裂解物组分，或者所述抗原组分可以为肿瘤组织/癌细胞的全细胞裂解物组分中的一部分组分。
[0012]所述全细胞裂解物组分包含水溶性组分和非水溶性组分，非水溶性组分使用含有溶解剂(或称增溶剂)的溶解液(或称增溶液)溶解(或称增溶)。
[0013]优选地，步骤(2)中，所述肿瘤抗原组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解得到，或者由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解后加工得到，或者由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞加工后裂解得到，优选所述癌细胞或肿瘤组织中至少有一种与目标疾病类型相同；或者所述抗原组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织中的一部分组分组成，一部分组分中含有裂解液中的蛋白质/多肽组分和/或mRNA组分；
[0014]本专利技术优选的技术方案中，所述全细胞抗原组分为全细胞裂解物组分中的一部分组分时，抗原组分中含有全细胞裂解物组分中的蛋白质和多肽组分和/或mRNA组分。
[0015]优选地，负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子可以与抗原提呈细胞和T细胞三者同时共孵育以激活癌细胞特异性T细胞；也可以负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子先与抗原提呈细胞共孵育激活抗原提呈细胞，然后将被激活的抗原提呈细胞再单独与T细胞二者一起共孵育以激活癌细胞特异性T细胞；负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子先与抗原提呈细胞共孵育激活抗原提呈细胞后，抗原提呈细胞可以不经过特殊处理再去与T细胞二者共孵育激活特异性T细胞，或者抗原提呈细胞可以经过固定、辐射、照射、修饰、灭活、矿化等处理后再与T细胞二者共孵育激活特异性T细胞。
[0016]本专利技术优选的技术方案中，所述步骤(1)，分离得到外周血或者外周免疫系统的免疫细胞的同种同体或同种异体在分离提取上述细胞时可以不经任何处理，或者经过放疗、免疫治疗、化疗、粒子治疗、疫苗治疗处理。
[0017]本专利技术优选的技术方案中，所述步骤(1)分选得到的T细胞为CD3
+
T细胞、CD3
+
CD8
+
T细胞、CD3
+
CD4
+
T细胞中的任一种或其组合。
[0018]本专利技术优选的技术方案中，所述步骤(1)和步骤(2)中的分选方法为流式细胞术、磁珠法的任一种或其组合。在分选被激活的癌细胞特异性T细胞时，可以使用一种T细胞被激活的激活标志物，也可以使用一种以上的不同标志物的组合作为激活标志物。
[0019]本专利技术优选的技术方案中，步骤(2)中，所述肿瘤抗原组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解得到，或者由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解后加工得到，或者由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞加工后裂解得到，优选所述癌细胞或肿瘤组织中至少有一种与目标疾病类型相同；或者所述抗原组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织中的一部分组分组成，一部分组分中含有裂解液中的蛋白质/多肽组分和/或mRNA组分。
[0020]本专利技术优选的技术方案中，抗原组分可以为：(1)癌细胞/肿瘤组织全细胞裂解物组分；(2)或者为含有癌细胞/肿瘤组织全细胞裂解物组分中的蛋白质和多肽组构成的的全细胞组分中的一部分组分；(3)或者为癌细胞/肿瘤组织全细胞组分中的蛋白质多肽组分加上mRNA组分。
[0021]本专利技术优选的技术方案中，所述肿瘤抗原组分为肿瘤组织和/或癌细胞的细胞裂
解组分，包含有肿瘤组织和/或癌细胞细胞裂解后产生的水溶性组分和非水溶性组分的一种或两种，先分别收集水溶性组分和水不溶性组分并分别制备纳米或微米粒子；或者也可以直接采用含有增溶剂的增溶液直接裂解癌细胞或肿瘤组织并溶解全细胞组分并制备纳米或微米粒子，所述非水溶性组分由含有溶解剂的溶解液溶解。或者也可以为上述裂解液组分经过适当处理后所得蛋白质和多肽组分，或者蛋白质和多肽组分加上mRNA组分。
[0022]本专利技术优选的技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于自体或同种异体的用于预防或治疗癌症的癌症特异性T细胞的制备方法，具体包括如下步骤：先分离得到外周血或者外周免疫器官的免疫细胞，然后与抗原提呈细胞以及负载癌症全细胞组分或含全细胞部分抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子共孵育一段时间激活癌症特异性T细胞，尔后分离得到被癌症抗原激活的癌症特异性T细胞，经过体外扩增后回输机体内发挥抗癌作用；优选地，所述制备方法具体包括如下步骤：(1)先分离得到外周血或者外周免疫器官的免疫细胞，或者从所述免疫细胞中分选得到T细胞；(2)将负载有肿瘤抗原组分的微米粒子和/或纳米粒子与抗原提呈细胞以及T细胞混合后共孵育一定时间，然后分选出被激活并表达特定细胞标志物的T细胞；(3)将步骤(2)分选得到的表达特定细胞标志物的T细胞与细胞因子和/或抗体共孵育，获得扩增后的特异性T细胞；优选地，步骤(2)中，所述肿瘤抗原组分为肿瘤组织/癌细胞全细胞裂解物组分或者肿瘤组织/癌细胞全细胞裂解物组分中的一部分组分；全细胞裂解物组分可以分为水溶性组分和含有溶解剂的溶解液溶解的非水溶性组分；优选地，步骤(2)中，所述肿瘤抗原组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解得到，或者由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解后加工得到，或者由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞加工后裂解得到，优选所述癌细胞或肿瘤组织中至少有一种与目标疾病类型相同；或者所述抗原组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织中的一部分组分组成，一部分组分中含有裂解液中的蛋白质/多肽组分和/或mRNA组分；优选地，步骤(1)中分选得到的T细胞为CD3
+
T细胞、CD3
+
CD8
+
T细胞、CD4
+
T细胞中的任一种或其组合。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子可以与抗原提呈细胞和T细胞三者同时共孵育以激活癌细胞特异性T细胞；也可以负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子先与抗原提呈细胞共孵育激活抗原提呈细胞，然后将被激活的抗原提呈细胞再单独与T细胞二者一起共孵育以激活癌细胞特异性T细胞；负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子先与抗原提呈细胞共孵育激活抗原提呈细胞后，抗原提呈细胞可以不经过特殊处理再去与T细胞二者共孵育激活特异性T细胞，或者抗原提呈细胞可以经过固定、辐射、照射、修饰、灭活、矿化等处理后再与T细胞二者共孵育激活特异性T细胞；在分选癌细胞特异性T细胞时，可以使用一种标志物作为激活标志物进行分选，也可以使用多个标志物的组分作为激活标志物进行分选。3.如权利要求1
‑
2任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤抗原组分为肿瘤组织和/或癌细胞的细胞裂解组分，包含有肿瘤组织和/或癌细胞细胞裂解后产生的水溶性组分和非水溶性组分的一种或两种，先分别收集水溶性组分和水不溶性组分并分别制备纳米或微米粒子，非水溶性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解；或者也可以直接采用含有溶解剂的溶解液直接裂解癌细胞或肿瘤组织并溶解全细胞组分并制备纳米或微米粒子，所述非水溶性组分由含有溶解剂的溶解液溶解；优选地，抗原组分为肿瘤组织/癌细胞全细胞裂解物组分时其制备方法为：(1)先裂解癌细胞/肿瘤组织，然后分别制备水溶性组分和非水溶性组分，然后将非水溶性组分使用特
定含有溶解液的溶解剂溶解后使用；(2)使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解裂解后的全细胞组分。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤抗原组分为含有肿瘤组织和/或癌细胞的全细胞裂解组分中的一部分组分时，其制备方法为：(1)先制备肿瘤组织/癌细胞的裂解液，，然后分别制备水溶性组分和非水溶性组分，然后将非水溶性组分使用特定含有溶解液的溶解剂溶解后使用，然后从水溶性组分中使用适当方法分离提取水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，然后将水溶性组分中分离提取的蛋白质和多肽组分与所有非水溶性组分一起作为抗原组分使用；(2)先制备肿瘤组织/癌细胞的裂解液，然后分别制备水溶性组分和非水溶性组分，然后将非水溶性组分使用特定含有溶解液的溶解剂溶解后使用，然后从非水溶性组分中使用适当方法分离提取水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，然后将非水溶性组分中分离提取的蛋白质和多肽组分与所有水溶性组分一起作为抗原组分使用；(3)先制备肿瘤组织/癌细胞的裂解液，，然后分别制备水溶性组分和非水溶性组分，然后将非水溶性组分使用特定含有溶解液的溶解剂溶解后使用，然后从水溶性组分和非水溶性组分中使用适当方法分别分离提取水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，然后将水溶性组分中和非水溶性组分中分离提取的蛋白质和多肽组分一起作为抗原组分使用；(4)或者也可以直接采用含有溶解剂的溶解液直接裂解细胞或组织并溶解全细胞组分，然后通过适当方法制备其中的蛋白质/多肽组分，作为抗原组分使用。上述制备方法中还可以增加分离提取全细胞mRNA的步骤，并将全细胞mRNA作为抗原组分的一部分使用。所述适当处理方法包括但不限于盐析、加热和酶解等处理方法；所述非水溶性组分或者经过盐析、加热和酶解等处理后产生的沉淀使用含有溶解剂的溶解液溶解。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)，所述分选得到的表达特定细胞标志物的T细胞为CD69、CD137、CD25、CD134、CD80、CD86、OX40L、OX40、CD28、FAS
‑
L、IL
‑
2R、HLA
‑
DR、CD127(IL
‑
7R)、CD150、CD107A、CD83、CD166、CD39、CD178、CD212、CD229、CD100、CD107b、CD108、CD109、CD113、CD122、CD126、CD253、CD197、PD
‑
1、TIM3、LAG
‑
3、TIGIT、CD62L、CD70、CTLA
‑
4(CD152)、CD27、CD26、CD30、TNFRSF9、CD74、PD
‑
L1(CD274)、CD258、CD261、4
‑
1BB、CD154、ICAM
‑
1、LFA
‑
1、LFA
‑
2、VLA
‑
4、CD160、CD71、CXCR3、TNFRSF14、TNFRSF18、TNFSF4、TNFSF9、TNFSF14、CD11a、CD101、CD48、CD244、CD49a、CD95、CD44、CXCR 1、CD103、CD45RO、ICOS(CD278)、VTCN1、HLA2、LGAL59、CCR7、CD357、BCL6、TCF
‑
1、CD38、CD27中的任一种或其组合。6.一种来源于自体或同种异体的用于预防或治疗癌症的癌症特异性T细胞的制备方法，具体包括如下步骤：(1)从外周血或外周免疫器官的免疫细胞中分离单个核细胞PBMC；优选地，所述PBMC经过第一步分选，获得以下至少一种效应性细胞：CD3
+
CD8
+
T细胞、CD19
+
B细胞、CD3
+
T细胞、CD8
+
T细胞、CD4
+
T细胞、B220
+
B细胞、CD69
‑
的PBMC细胞、CD25
‑
的PBMC细胞、CD3
+
CD69
+
T细胞、CD11c
+
DC细胞；(2)制备负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子；优选地，所述肿瘤抗原组分的制备为先分离得到肿瘤细胞或组织，裂解所述肿瘤细胞或组织获得水溶性组分、非水溶性组分、全组分的任一种或其组合；优选地，负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子利用复乳法制备；
(3)在培养基中加入负载有肿瘤抗原组分的纳米粒子和/或微米粒子，与(1)所述的PBMC细胞或T细胞共孵育，得细胞培养物，从细胞培养物中进一步分选出特异性T细胞，所述特异性T细胞为包括但不限于CD3
+
CD69
+
、CD3
+
CD8
+
CD69
+
、CD3
+
CD4
+
CD69+、CD3
+
CD137
+
、CD3
+
CD4
+
CD137
+
、CD3
+
CD8
+
CD137
+
、CD3
+
CD25
+
、CD3
+
CD8
+
CD25
+
、CD3
+
CD4
+
CD25
+
、、CD3
+
CD134
+
、CD3
+
CD8
+
CD134
+
、CD3
+
CD4
+
CD134
+
、CD3
+
IL
‑
2R
+
、CD3
+
CD8
+
IL
‑
2R
+
、CD3
+
CD4
+
IL
‑
2R
+
、CD3
+
HLA
‑
DR
+
、CD3
+
CD8
+
HLA
‑
DR
+
、CD3
+
CD4
+
HLA
‑
DR
+
、CD3
+
FASL
+
CD3
+
CD8
+
FASL
+
、CD3
+
CD4
+
FASL
+
、CD3
+
OX40
+
、CD3
+
CD8
+
OX40
+
、CD3
+
CD4
+
OX40
+
、CD3
+
TCF
‑1+
、CD3
+
CD8
+
TCF
‑1+
、CD3
+
CD4
+
TCF
‑1+
、CD3
+
PD
‑1+
、CD3
+
CD8
+
PD
‑1+
、CD3
+
CD4
+
PD
‑1+
、CD3
+
CD39
+
、CD3
+
CD8
+
CD39
+
、CD3
+
CD4
+
CD39
+
、CD3
+
CD38
+
、CD3
+
CD8
+
CD38
+
、CD3
+
CD4
+
CD38
+
、CD3
+
CD28
+
、CD3
+
CD8
+
CD28
+
、CD3
+
CD4
+
CD28
+
、、CD3
+
CD71
+
、CD3
+
CD8
+
CD71
+
、CD3
+
CD4
+
CD71
+
、CD3
+
CD44
+
、CD3
+
CD8
+
CD44
+
、CD3
+
CD4
+
CD44
+
、CD3
+
CXCR3
+
、CD3
+
CD8
+
CXCR3
+
、CD3
+
CD4
+
CXCR3
+
、CD3
+
CXCR1
+
、CD3
+
CD8
+
CXCR1
+
、CD3
+
CD4
+
CXCR1
+
、CD3
+
ICAM
‑1+
、CD3
+
CD8
+
ICAM
‑1+
、CD3
+
CD4
+
ICAM
‑1+
、CD3
+
CD70
+
、CD3
+
CD8
+
CD70
+
、CD3
+
CD4
+
CD70
+
、CD3
+
CD154
+
、CD3
+
CD8
+
CD154
+
、CD3
+
CD4
+
CD154
+
、、CD3
+
CD62L
+
、CD3
+
CD8
+
CD62L
+
、CD3
+
CD4
+
CD62L
+
、CD3
+
CD154
+
、CD3
+
CD8
+
CD154
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘密，
申请(专利权)人：苏州尔生生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：