本发明专利技术涉及一种负载癌细胞裂解物组分的癌症粒子疫苗的终端灭菌方法及其应用，属于免疫治疗技术领域。本发明专利技术采用特定辐照灭菌进行终端灭菌的方法，可以在制备完疫苗冻干制剂且密封好以后再使用射线等辐照灭菌，操作更便捷，对场地、器械等要求也较低。经验证发现，辐照处理后制剂符合中国药典无菌检查法的规定，达到注射制剂无菌要求，制剂保持稳定且可长期保存。虽然辐照灭菌处理会对被辐照的物质中所含的成分产生一定的影响，但是却没有降低负载裂解物组分的纳米/微米疫苗或粒子的功效，意外的是，辐照灭菌后纳米/微米疫苗直接注射进入机体或者体外激活其他免疫细胞的的功效比全程无菌制备的纳米/微米疫苗疗效更佳，在肿瘤治疗领域具有重要应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种负载癌细胞和/或肿瘤组织裂解物中全部组分或部分组分的纳米疫苗(递送粒子)或微米疫苗(递送粒子)的终端灭菌方法及其应用。
技术介绍
1、癌症疫苗是癌症免疫治疗的重要方法之一。影响癌症疫苗的主要因素包括肿瘤抗原、佐剂和递送剂型。其中，抗原可以诱导激活特异性免疫反应，佐剂可以放大特异性的免疫反应，剂型可以影响抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,apcs)对疫苗的吞噬和后续激活抗原特异性t细胞的效率。在这三者中，抗原是能够引发特异性免疫反应的主要成分，因而是最关键的组分。癌细胞和/或肿瘤组织含有全部的癌细胞特异性抗原和癌细胞相关抗原，因而癌细胞或肿瘤组织裂解液是最好的癌症疫苗制备原料。专利技术人研发了负载癌细胞/肿瘤组织全细胞裂解液组分或部分裂解液组分的纳米疫苗或微米疫苗，所制备的纳米疫苗或微米疫苗粒径一般在几百纳米到几微米。疫苗一般要注射使用，注射剂要求是无菌制剂，有比较严格的无菌要求，且要求要么是终端灭菌，要么要保证过程全程无菌。过程无菌对于企业场地、设备、器械等的要求都更高，因而成本也更好，对管理要求也更高。而对于终端灭菌，一般是使用0.22μm(220nm)的滤膜过滤。使用0.22μm的滤膜过滤灭菌对于直径小于150nm的纳米疫苗来说较为可行，对于直径大于200nm的纳米疫苗使用0.22μm的滤膜过滤灭菌并不可行。因而亟需研究可行的终端灭菌方法，这对于纳米疫苗的产业化应用、降低成本、提高效率等至关重要。
技术实现思路
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p>1、专利技术要解决的问题2、为了解决全程无菌制备纳米疫苗所需场地、设备、管理等要求更高，因而成本等也更高的问题，本专利技术提供了一种使用特定辐照灭菌进行终端灭菌的方法，可以在制备完疫苗冻干制剂且密封好以后再使用射线等辐照灭菌，操作更便捷，对场地、器械等要求也较低。经验证，发现辐照处理会对被辐照的物质中所含的成分产生一定的影响，但是却没有降低负载裂解物组分的纳米/微米疫苗或粒子的功效。而且，辐照灭菌后纳米/微米疫苗(粒子)直接注射进入机体或者体外激活其他免疫细胞的的功效比全程无菌制备的纳米/微米疫苗(粒子)疗效更佳，取得了意想不到的效果。
3、用于解决问题的方案
4、一种负载癌细胞或肿瘤组织的裂解物中抗原组分的癌症纳米粒子(疫苗)或微米粒子(疫苗)的终端灭菌方法，灭菌方式为辐照灭菌1小时-48小时；所述辐照为使用12～60kgy剂量的x射线、γ射线、α射线、β射线、1-100mev电子束中的一种或多种处理；
5、所述纳米粒子或微米粒子具有：(i)粒子制备材料形成的纳米粒子和/或微米粒子骨架结构、(ii)来自癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解液组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分；其中，所述来自癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解液组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分负载于所述骨架结构的内部和/或表面；
6、其中，所述来自癌细胞和/或肿瘤组织裂解物组分中的全细胞组分全部使用含溶解剂的溶解液溶解；或者所述来自癌细胞和/或肿瘤组织裂解物组分中的全细胞组分包含水溶性组分和使用含溶解剂的溶解液溶解的非水溶性组分；所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含癌细胞和/或肿瘤组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞裂解物中的rna组分或mrna组分，所述含有抗原组分的部分裂解液组分为使用适当方法从裂解物中分离提纯得到；
7、所述经过辐照终端灭菌的负载载癌细胞或肿瘤组织的裂解物中抗原组分的癌症纳米粒子(疫苗)或微米粒子(疫苗)可以直接注射进入机体作为疫苗使用或者作为抗原递送粒子用于体外激活其他细胞。
8、进一步地，所述终端灭菌方法为辐照灭菌1小时-48小时、12-60kgy或1-100mev；优选为辐照灭菌4-24小时；更优选为辐照6-16小时。
9、进一步地，所述辐照为使用x射线、γ射线、α射线、电子束、β射线等不同辐照方法中的一种或多种处理；优选为使用γ射线、α射线、β射线、电子束、x射线中的一种或多种，更优选为使用γ射线或x射线或电子束。
10、进一步地，所述癌症纳米疫苗或纳米粒子(抗原递送纳米粒子)的粒径为1nm-1000nm；优选为50-500nm；更优选为100-400nm；所述微米疫苗或微米粒子(抗原递送微米粒子)的粒径为1μm-1000μm；优选为1-10μm；更优选为1-5μm。
11、进一步地，使用纳米/微米疫苗(粒子)的混合疫苗(粒子)时，所述纳米疫苗或纳米粒子(抗原递送纳米粒子)的粒径为100-600nm，微米疫苗或微米粒子(抗原递送微米粒子)粒径为1.5-5μm；优选地纳米疫苗或纳米粒子(抗原递送纳米粒子)的粒径为150-500nm，微米疫苗或微米粒子(抗原递送微米粒子)粒径为2.0-3.5μm。
12、进一步地，在纳米疫苗或纳米粒子(抗原递送纳米粒子)或者微米疫苗或微米粒子(抗原递送微米粒子)的制备材料(plga或者pla等主要材料)中加入适量提高稳定性的物质或促进靶向的物质修饰。优选地，peg修饰的plga或者pla，可以更好的达到长循环和被动靶向的效果；其中peg修饰的plga或者pla等与未修饰的plga或者pla质量比为0.05％到20％，优选为0.1％到10％。
13、进一步地，本专利技术所述的癌细胞来源为任何可以获得癌细胞的方法，包括但不限于癌细胞系、从肿瘤组织中分离提取出来的癌细胞经过体外扩增得到的癌细胞、从血液中分离提取出来的循环肿瘤细胞经过扩增得到的癌细胞或者从干细胞分化培养的癌细胞等。
14、优选地，所述癌细胞来自一个或者多个机体，或者来自一种或多种癌细胞系；所述肿瘤组织来自一个或者多个机体；所述癌细胞的裂解液或肿瘤组织的裂解液中的蛋白质和多肽组分/mrna组分(或rna组分)中含有抗原组分；所述癌细胞和/或肿瘤组织中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分/mrna组分(或rna组分)和癌细胞和/或肿瘤组织中的非水溶性组分/非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分/mrna组分(或rna组分)中含有抗原组分。
15、进一步地，所述抗原组分可以为蛋白质多肽组分，也可以为蛋白质多肽组分和总rna组分的混合物，也可以为蛋白质多肽组分和总mrna组分的混合物。
16、进一步地，所述纳米/微米疫苗(粒子)进一步负载至少一种如下所示的组分：
17、(iii)水溶性组分和/或非水溶性组分中的mrna组分或rna组分；
18、(iv)免疫佐剂；
19、(v)带正电荷的物质，
20、优选地，所述免疫佐剂包括如下至少一种：模式识别受体类激动剂、toll样受体激动剂、卡介苗(bcg)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、咪喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂cpg、免疫佐本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种负载抗原组分的癌症粒子疫苗或抗原递送粒子的终端灭菌方法，其特征在于，所述终端灭菌包括：对封装后的癌症粒子疫苗或抗原递送粒子进行辐照，所述辐照为使用12～60kGy剂量的X射线、γ射线、α射线、β射线或1-100MeV电子束处理1～48小时；所述癌症粒子疫苗中含有抗原递送粒子，所述抗原递送粒子为纳米粒子或微米粒子；
2.根据权利要求1所述的终端灭菌方法，其特征在于，所述终端灭菌的具体步骤如下：
3.根据权利要求1所述的终端灭菌方法，其特征在于，所述粒子制备材料选自天然高分子材料、合成高分子材料、无机材料、细菌或病毒来源的生物材料中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的终端灭菌方法，其特征在于：所述粒子制备材料为聚乙二醇修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或聚乙二醇修饰的聚乳酸。
5.根据权利要求1所述的终端灭菌方法，其特征在于：所述来自癌细胞和/或肿瘤组织裂解物组分中的全细胞组分通过全部使用含溶解剂的溶解液溶解癌细胞和/或肿瘤组织得到，或包含水溶性组分和使用含溶解剂的溶解液溶解的非水溶性组分；所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含癌细胞和/或肿瘤组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞裂解物中的RNA组分或mRNA组分。
6.根据权利要求5所述的终端灭菌方法，其特征在于，所述抗原递送粒子的制备方法如下：
7.根据权利要求5所述的终端灭菌方法，其特征在于，所述抗原递送粒子的制备方法如下：
8.权利要求1-7任一项所述的终端灭菌方法或通过该终端灭菌方法制备得到的癌症粒子疫苗或抗原递送粒子在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用为，将含有抗原递送粒子的癌症粒子疫苗注射进机体，或使用抗原递送粒子体外激活免疫细胞，再将免疫细胞回输进机体。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用至少包括下述之一：
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【技术特征摘要】
1.一种负载抗原组分的癌症粒子疫苗或抗原递送粒子的终端灭菌方法，其特征在于，所述终端灭菌包括：对封装后的癌症粒子疫苗或抗原递送粒子进行辐照，所述辐照为使用12～60kgy剂量的x射线、γ射线、α射线、β射线或1-100mev电子束处理1～48小时；所述癌症粒子疫苗中含有抗原递送粒子，所述抗原递送粒子为纳米粒子或微米粒子；
2.根据权利要求1所述的终端灭菌方法，其特征在于，所述终端灭菌的具体步骤如下：
3.根据权利要求1所述的终端灭菌方法，其特征在于，所述粒子制备材料选自天然高分子材料、合成高分子材料、无机材料、细菌或病毒来源的生物材料中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的终端灭菌方法，其特征在于：所述粒子制备材料为聚乙二醇修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或聚乙二醇修饰的聚乳酸。
5.根据权利要求1所述的终端灭菌方法，其特征在于：所述来自癌细胞和/或肿瘤组织裂解物组分中的全细胞组分通...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘金生，
申请(专利权)人：苏州尔生生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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