一种奶畜乳腺类器官的建立方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种奶畜乳腺类器官的建立方法及其应用，建立方法包括以下步骤：(1)将获得的乳腺组织进行剪碎、消化处理，得到消化液；(2)将步骤(1)制备的消化液经过NH4Cl、胰酶、Dispase，DNaseI处理，得到单细胞悬液；(3)采用基质胶重悬步骤(2)制备得到的单细胞悬液，并将重悬液接种于培养板，在培养箱内培养，使得所述重悬液固化；(4)向培养孔内加入培养基在培养箱内进行培养，获得奶畜乳腺类器官。本发明专利技术成功分离了乳腺类器官组织，建立了大型奶畜乳腺类器官培养体系，对于解析奶畜乳腺发育的过程，为提高奶畜泌乳的研究深度提供可靠模型。型。型。

【技术实现步骤摘要】
一种奶畜乳腺类器官的建立方法及其应用


[0001]本专利技术属于类器官模型建立
，具体涉及一种奶畜乳腺类器官的建立方法及其应用。

技术介绍

[0002]奶牛、奶山羊等奶畜所产生的鲜奶是人类重要的营养物质来源。因此，在畜牧学上，解析奶畜乳腺发育的生物学基础是最为热门的科学问题，解析乳腺发育的过程，挖掘调控其发育的关键通路或者基因对于基因育种具有重要意义。
[0003]相对于小鼠而言，奶牛、奶山羊作为大型哺乳动物，具有体型大、生殖周期长、不易采样且不易进行体内通路验证试验等特点。3D类器官培养相对于2D常规细胞培养更接近复杂体内条件的特征，且会使其行为更接近自然条件，减少了细胞培养系统和细胞生理学之间的差距，从而模拟部分组织和器官的生理功能。因此，建立起乳腺类器官的培养体系显得非常必要。牛羊乳腺类器官培养体系的建立可以提供大量的乳腺组织和细胞，供研究人员开展基础和应用研究。通过对乳腺类器官的体外培养，可以更好地理解乳腺组织的结构、生理特性、分泌功能等等，从而更好地研究乳腺疾病的发病机制和治疗方法。此外，乳腺类器官培养体系还可以为新药筛选和药效评估提供高效、经济的模型。
[0004]目前，虽然在小鼠模型上，已有开展乳腺类器官的培养的研究，但作为大型哺乳动物，其乳腺结构和特征与小鼠模型有着显著的区别。在奶牛等反刍动物上已开展了乳腺类器官培养的探索，但他们的细胞来源单一，培养的类器官细胞种类单一，或者不具备诱导泌乳的功能，难以体现乳腺类器官的生理特征。如何成功建立乳腺类器官培养体系仍面临着许多挑战和困难。其中一个主要问题是如何确保培养出来的乳腺类器官与体内的器官相似。要解决这个问题，需要开展大量的试验探究，建立乳腺类器官的培养模式，探索不同培养条件对器官发育和分化的影响，并进行相关的优化。通过该技术的建立，可以更深入地研究乳腺组织的发育和泌乳过程。总之，建立奶牛、羊等大型哺乳动物的乳腺类器官培养体系，对于解析奶畜乳腺发育的过程，为提高奶畜泌乳的研究深度提供可靠模型。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种奶畜乳腺类器官的建立方法及其应用，本专利技术成功分离了乳腺类器官组织，建立了大型奶畜乳腺类器官培养体系，对于解析奶畜乳腺发育的过程，为提高奶畜泌乳的研究深度提供可靠模型。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术采取的技术方案是：
[0007]一种奶畜乳腺类器官的建立方法，包括以下步骤：
[0008](1)将获得的乳腺组织进行剪碎、消化处理，得到消化液；
[0009](2)将步骤(1)制备的消化液经过NH4Cl、胰酶、Dispase，DNaseI处理，得到单细胞悬液；
[0010](3)采用基质胶重悬步骤(2)制备得到的单细胞悬液，并将重悬液接种于培养板，
在培养箱内培养，使得重悬液固化；
[0011](4)向培养孔内加入培养基在培养箱内进行培养，获得奶畜乳腺类器官。
[0012]优选地，步骤(4)中的培养基为含有如下组分的DMEM/F12培养基：胰岛素、青霉素
‑
链霉素双抗、支原体清除剂、EGF、FGF2、FGF7、FGF10。
[0013]优选地，培养基中各组分的浓度如下：胰岛素：5μg/L；青霉素
‑
链霉素双抗：1％；支原体清除剂：1
‰
；EGF：50ng/mL；FGF2：2.5nM；FGF7：2.5nM；FGF10：2.5nM。
[0014]优选地，步骤(1)中的乳腺组织来源于大型奶畜，优选为8
‑
12月龄未配种奶山羊或8
‑
16月龄未孕奶牛。
[0015]优选地，步骤(1)的具体操作为：将获得的3g大小的乳腺组织转移至大培养皿中，用手术剪将组织剪碎成糊状，全程在超净台中进行，将糊状组织转移至含消化培养基的50mL离心管内，置于37℃温控摇床内200rpm消化1.5
‑
2h；
[0016]优选地，消化培养基含有如下组分：8mLDME/F
‑
12培养基、1mL胶原酶、1mL透明质酸酶、体积百分数为5％的FBS。
[0017]优选地，步骤(2)中，NH4Cl、胰酶、Dispase使用前在37℃水浴锅内预热，DNaseI在使用前解冻。
[0018]优选地，步骤(3)中基质胶为ECM基质胶，使用前提前4℃解冻ECM基质胶，培养板在37℃培养箱孵育30min，单细胞悬液中类器官数量与ECM基质胶的体积关系为100:1
‑
2:1。
[0019]优选地，步骤(4)中培养时间为4
‑
6天。
[0020]为解决以上技术问题，本专利技术采取的又一技术方案是：
[0021]一种奶畜乳腺类器官，采用如上所述的建立方法制备得到。
[0022]为解决以上技术问题，本专利技术采取的又一技术方案是：
[0023]如上所述的奶畜乳腺类器官在研究奶畜乳腺发育过程和功能、制备细胞奶、筛选抗乳腺癌药物中的应用。
[0024]由于以上技术方案的采用，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：
[0025]本专利技术成功分离了乳腺类器官组织，建立了大型奶畜乳腺类器官培养体系，其具有如下特点：
[0026](1)培养的乳腺类器官具有乳腺腺泡的双层结构；
[0027](2)培养的乳腺类器官能够响应生长因子；
[0028](3)培养的乳腺类器官能够模拟乳腺的泌乳、退化等生理过程；
[0029](4)培养的乳腺类器官在分子表达水平上具有和活体乳腺类器官相似的表达模式。
[0030]本专利技术大型奶畜乳腺类器官培养体系的建立对于解析奶畜乳腺发育的过程，为提高奶畜泌乳的研究深度提供可靠模型。
附图说明
[0031]图1为乳腺类器官的分离及培养流程图；
[0032]图2为奶山羊乳腺类器官形态学免疫荧光染色图，其中：(a)冰冻切片染色；(b)整体染色；
[0033]图3为不同生长因子培养基对乳腺类器官生长状态的影响图，其中：(a)不同生长
因子处理后乳腺类器官生长结果图；(b)各组生长面积统计分析图；
[0034]图4为乳腺类器官模拟泌乳状态图，其中：(a)模拟泌乳状态实验示意图；(b)模拟泌乳状态后乳腺类器官生长结果图；(c)生长面积统计分析图；
[0035]图5为泌乳相关基因RT
‑
qPCR检测图；
[0036]图6为乳腺类器官模拟泌乳状态时的形态结构图；
[0037]图7为乳腺类器官模拟泌乳效应增强图；
[0038]图8为乳腺类器官模拟退化状态图，其中：(a)模拟退化状态实验示意图；(b)模拟退化状态后乳腺类器官泌乳状况图；
[0039]图9为乳腺类器官转录组测序分析图，其中：(a)乳腺类器官样品相关性分析；(b)差异表达基因火山图；
[0040]图10为KEGG富集分析图，其中：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种奶畜乳腺类器官的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将获得的乳腺组织进行剪碎、消化处理，得到消化液；(2)将步骤(1)制备的消化液经过NH4Cl、胰酶、Dispase，DNaseI处理，得到单细胞悬液；(3)采用基质胶重悬步骤(2)制备得到的单细胞悬液，并将重悬液接种于培养板，在培养箱内培养，使得所述重悬液固化；(4)向培养孔内加入培养基在培养箱内进行培养，获得奶畜乳腺类器官。2.根据权利要求1所述的奶畜乳腺类器官的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)中的培养基为含有如下组分的DMEM/F12培养基：胰岛素、青霉素
‑
链霉素双抗、支原体清除剂、EGF、FGF2、FGF7、FGF10。3.根据权利要求2所述的奶畜乳腺类器官的建立方法，其特征在于，所述培养基中各组分的浓度如下：胰岛素：5μg/L；青霉素
‑
链霉素双抗：1％；支原体清除剂：1
‰
；EGF：50ng/mL；FGF2：2.5nM；FGF7：2.5nM；FGF10：2.5nM。4.根据权利要求1所述的奶畜乳腺类器官的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中的乳腺组织来源于大型奶畜，优选为8
‑
12月龄未配种奶山羊或8
‑
16月龄未孕奶牛。5.根据权利要求1所述的奶畜乳腺类器官的建立方...

【专利技术属性】
技术研发人员：石恒波，张文颖，刘建新，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：