一种针对UBA52基因的shRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种针对UBA52基因的shRNA及其应用，所述的shRNA的碱基序列如SEQ ID No.1所示。将本发明专利技术发夹型干扰RNA(UBA52shRNA)转染入人肝癌细胞系后，UBA52基因和蛋白的表达量明显降低，并能抑制细胞增殖能力，黏附能力和侵袭能力，并且能抑制细胞在裸鼠皮下瘤的增长，具有潜在的治疗肿瘤的价值。这段shRNA能够通过RNA干扰途径(RNAi)，特异性降低人肝癌细胞系(SK

【技术实现步骤摘要】
一种针对UBA52基因的shRNA及其应用


[0001]本专利技术属于生物
,涉及一个能通过RNA干扰途径特异降低细胞内UBA52基因表达量的发夹型小干扰RNA(UBA52 shRNA)的序列；以及利用这种发夹型小干扰RNA(shRNA)对UBA52基因进行特异性干扰后抑制细胞增殖和转移的作用，尤其是抑制肝癌细胞系(SK
‑
HEP
‑
1)增殖和转移的作用。

技术介绍

[0002]肝脏是机体主要的代谢器官，原癌基因或抑癌基因的致癌突变会改变代谢，以满足不受抑制的细胞增殖和肿瘤生长对营养和生长的需求。代谢重编程是肿瘤的重要特征之一，肝脏是体内三大营养物质糖、脂质、氨基酸代谢的重要枢纽。肝细胞癌(HCC)中可呈现多种特征性代谢改变，如有氧糖酵解增加、脂肪从头合成增强、谷氨酰胺分解代谢加速和氧化还原代谢失衡等，从而为快速生长和增殖的肿瘤细胞提供能量和生物大分子合成原料。肿瘤代谢重编程过程受代谢酶活性改变、基因表达异常、信号转导通路失调等多因素调节。深入研究HCC的代谢特征及调控机制对于以肿瘤代谢为靶点的新型抗代谢药物的研发至关重要。
[0003]作为体内重要生理途径，泛素蛋白酶体降解途径与肝癌息息相关。有关泛素化与肝癌的研究主要集中在肝癌发病的分子机制、早期诊断及靶向治疗方面。
[0004]研究表明肿瘤代谢重编程过程受代谢酶活性改变、基因表达异常、信号转导通路失调等多因素调节，进而影响肝癌的发生发展。
[0005]UBA52是一个新近发现的基因，UBA52是一种泛素核糖体融合蛋白,该种蛋白是泛素与核糖体蛋白融合而成。泛素是大多数真核细胞中的小蛋白，主要功能是标记需要分解的蛋白质，使其被水解，泛素由四种不同的基因编码的，包括UBA52、Ubb、Ubc、Uba80。在人类中，UBA52基因编码的泛素融合到核糖体蛋白L40上，从而形成泛素核糖体融合蛋白。UBA52是由128个氨基酸构成，包括由52个氨基酸构成的60S核糖体蛋白与由76个氨基酸构成的泛素肽链。目前认为泛素核糖体融合蛋白与一些疾病相关蛋白或基因的增多呈正相关。其中UBA52在肿瘤基因组图谱TCGA数据库中显示肝癌高表达，并且UBA52表达越高，预后越差。最近的研究结果表明，UBA52在促进肿瘤细胞增殖和黏附侵袭的过程中发挥重要作用。因此，抑制UBA52基因的转录和表达可能是抑制肿瘤细胞增殖和转移的有效方法。
[0006]shRNA(short hairpin RNA)是“短发夹RNA”，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5
‑
6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。利用shRNA干涉基因可以克服siRNA作用时间短暂的缺点，是一种稳定沉默基因的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种针对UBA52基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用，该shRNA可以特异性抑制人UBA52基因表达。
No.1所示，即：
[0030]5’‑
CCGGGCAAGAAGAAGUGUGGUCACACUCGAGUGUGACCACACUUCUUC UUGCUUUUU
‑3’
；其针对的靶序列如SEQ ID No.2所示，即GCAAGAAGAAGUGUGGUCACA。
[0031]针对UBA52基因的shRNA，该shRNA通过如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即
[0032]5’‑
CCGGGCAAGAAGAAGTGTGGTCACACTCGAGTGTGACCACACTTCTTCTT GCTTTTT
‑3’
或
[0033]5’‑
AATTAAAAAGCAAGAAGAAGTGTGGTCACACTCGAGTGTGACCACACTTC TTCTTGC
‑3’
；
[0034]具体通过包含如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸链的质粒转录生成。
[0035]将本专利技术发夹型干扰RNA(UBA52 shRNA)转染入人肝癌细胞系后，UBA52基因和蛋白的表达量明显降低，并能抑制细胞增殖能力，黏附能力和侵袭能力，并且能抑制细胞在裸鼠皮下瘤的增长，具有潜在的治疗肿瘤的价值。这段shRNA能够通过RNA干扰途径(RNAi)，特异性降低人肝癌细胞系(SK
‑
HPE
‑
1)中基因UBA52的表达，从而显著抑制SK
‑
HPE
‑
1细胞的增殖和转移。该发夹小RNA可以应用于抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中。
[0036]相关实验研究如下：
[0037]实验流程如图1所示：
[0038]针对UBA52基因shRNA的设计与合成：
[0039]根据UBA52基因全长mRNA序列，经分析设计，选择了UBA52基因全长mRNA序列(AF348700.1)第373～393碱基处，共21个核苷酸为靶向干涉的序列，被识别的具体序列如SEQ ID No.2所示，即：GCAAGAAGAAGUGUGGUCACA。针对该序列设计合成了一段高特异性的shRNA，该shRNA通过如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即
[0040]5’‑
CCGGGCAAGAAGAAGTGTGGTCACACTCGAGTGTGACCACACTTCTTCTT GCTTTTT
‑3’
或
[0041]5’‑
AATTAAAAAGCAAGAAGAAGTGTGGTCACACTCGAGTGTGACCACACTTC TTCTTGC
‑3’
转录后的shRNA碱基序列如SEQ ID No.1所示，即：
[0042]5’‑
CCGGGCAAGAAGAAGUGUGGUCACACUCGAGUGUGACCACACUUCUUC UUGCUUUUU
‑3’
；
[0043]UBA52基因shRNA表达载体的的设计与合成：
[0044]将该shRNA连接入真核表达载体pLKO.1puro，并进行测序，以确保正确的连接。测序结果表明UBA52 shRNA已正确连接入真核表达载体pLKO.1puro。构建好的载体标记为UBA52 shRNA。
[0045]UBA52 shRNA表达载体转染人肝癌细胞SK
‑
HPE
‑
1：
[0046]细胞培养至50％
‑
70％融合后，将shRNA表达载体与经1640培养基稀释的脂质体lipfectamine2000混匀后，室温孵育20分钟，加到接种的细胞中。转染24小时后，提取细胞总RNA经RT
‑
PCR分析UBA52 mRNA量。提取总蛋白经Western
‑
blot检测UBA52蛋白量。结果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对UBA52基因的shRNA，其特征在于，所述的shRNA的碱基序列如SEQ IDNo.1所示。2.一种针对UBA52基因的shRNA，其特征在于，所述的shRNA通过如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA寡核苷酸链转录生成。3.根据权利要求1或2所述的针对UBA52基因的shRNA，其特征在于，所述的UBA52基因序列如SEQ ID No.2所示。4.权利要求1或2所述的针对...

【专利技术属性】
技术研发人员：南刚，王婷，孙秀璇，王彬，王莉娟，蒋建利，陈志南，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：