香菇U6基因启动子及应用制造技术

本发明专利技术公开了5个香菇U6基因启动子及应用，从香菇中克隆了5个RNA聚合酶Ⅲ型U6基因启动子，构建香菇U6基因启动子活性检测载体并通过农杆菌转化香菇菌丝和qRT

【技术实现步骤摘要】
香菇U6基因启动子及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及香菇U6基因启动子及应用。

技术介绍

[0002]香菇基因组及其不同发育阶段的转录组、蛋白质组和代谢组已被测序，产生了大量的候选基因用于功能鉴定。到目前为止，在香菇中已经开发了遗传转化、基因沉默和基因过表达技术，但CRISPR/Cas9基因编辑系统在香菇中的效率非常低。CRISPR/Cas9系统由两部分组成：细胞核表达的Cas9蛋白和功能性sgRNA。Cas9与sgRNA形成复合物，识别基因组中的目标区域，裂解序列以产生双链断裂(DSB)，细胞通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)修复DSB。
[0003]U6基因启动子是一种理想的RNA聚合酶III型启动子，用于驱动具有靶点的sgRNA的转录，sgRNA的表达量取决于启动子的强弱。当前U6启动子在灵芝、杏鲍菇和平菇等多种食用菌的CRISPR/Cas9系统中成功应用。U6基因启动子一般具有种属特异性，且同一物种中的多个U6基因启动子在转录活性上会有所不同。在香菇转基因技术中，使用香菇本身或近缘物种的U6启动子，可以获得更高的的启动效率。
[0004]香菇作为世界上产量最高的食用菌，对其生物技术的研究越来越重要。尽管U6基因启动子在香菇的CRISPR/Cas9基因编辑系统中被使用，但香菇所有内源的U6基因启动子效率没有被评估，没能全面的对香菇U6基因启动子的克隆与应用进行研究。因此，香菇U6基因启动子的克隆和应用，对于丰富香菇生物技术手段，具有重要的实践意义。
专利
技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供了5个香菇U6基因启动子及其在基因编辑中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]用BLASTn方法在香菇W1
‑
26菌株基因组比对人类HsU6、裂殖酵母SpU6和拟南芥AtU6的同源序列，发现5个含有高度保守区域的香菇U6基因序列，其长度在113bp
‑
127bp，分别位于Scaffold0001、Scaffold0003、Scaffold0006、Scaffold0012和Scaffold0043，根据它们在基因组中的位置命名为LeU6
‑
1、LeU6
‑
2、LeU6
‑
3、LeU6
‑
4和LeU6
‑
5，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
5所示。
[0008]构建含有上述5个香菇U6基因启动子的sgRNA表达载体，通过农杆菌介导的香菇菌丝遗传转化方法，将5个sgRNA表达载体分别转化到香菇菌丝中，经过抗性筛选最终获得5个sgRNA表达载体的转化子，通过qRT
‑
PCR比较转化子、野生型(WT)和空载体(CK)菌株之间的sgRNA表达水平，发现5个内源U6基因启动子都能驱动sgRNA的转录，但转化子间的sgRNA表达效率不同。在所有的转化子中，LeU6
‑
3P启动子表达sgRNA的效果稳定且效率较高，表明其可以作为香菇CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统中RNA聚合酶III启动子驱动sgRNA表达。
附图说明
[0009]图1：多个物种的U6基因序列比对。
[0010]图2：pCAMBIA1300
‑
OE质粒图谱。
[0011]图3：5个sgRNA表达载体的构建策略。
[0012]图4：5个重组sgRNA表达载体验证。A.大肠杆菌菌落PCR鉴定：泳道1
‑
3为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
1P，泳道4
‑
6为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
3P，泳道7
‑
9为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
4P，泳道10
‑
12为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
2P，泳道13
‑
15为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
5P，M1为BM2000 Marker；B.农杆菌菌落PCR鉴定：泳道1
‑
5为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
1P，泳道6
‑
10为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
3P，泳道11
‑
15为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
4P，泳道16
‑
20为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
2P，泳道21
‑
26为pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
5P，M1为BM2000 Marker，M2为15kb DNA Marker。
[0013]图5：qRT
‑
PCR检测不同U6基因启动子驱动的sgRNA表达水平。A
‑
E为sgRNA在pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
1P、pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
2P、pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
3P、pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
4P、pCAMBIA1300
‑
LeU6
‑
5P载体转化子中的相对表达量，WT为W1菌株，CK为W1空载体菌株。
具体实施方式
[0014]实施例1香菇U6基因启动子的克隆
[0015]利用BLASTn的方法在香菇W1
‑
26菌株基因组(https://mycocosm.jgi.doe.gov/Lentinedodes1/Lentinedodes1.home.html)比对人类HsU6、裂殖酵母SpU6和拟南芥AtU6的同源序列，发现5个含有高度保守区域的香菇U6基因序列(图1)，其长度在113
‑
127bp，分别位于Scaffold0001、Scaffold0003、Scaffold0006、Scaffold0012和Scaffold0043，根据它们在基因组中的位置命名为LeU6
‑
1、LeU6
‑
2、LeU6
‑
3、LeU6
‑
4和LeU6
‑
5(表1)。选择LeU6基因上游340
‑
430bp大小的序列作为启动子，依次命名为LeU6
‑
1P、LeU6
‑
2P、LeU6
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.香菇U6基因启动子，其特征在于，包括5个U6基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。2.重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体含有权利要求1所述的香菇U6基因启动子。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述香菇U6基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.权利要求1所述的香菇U6基因启动子在香菇基因编辑中的应用。5.权利要求2或3所述的重组表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：周雁，徐瑞平，边银丙，宋佳鑫，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：