基于CRISPR-CAS13系统干预抑制寨卡病毒的方法及应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR
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CAS13系统干预抑制寨卡病毒的方法及应用


[0001]本专利技术属于病毒学领域以及基因
，更具体地，本专利技术涉及基于CRISPR
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CAS13系统干预抑制寨卡病毒的方法及应用。

技术介绍

[0002]寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是通过蚊虫传播的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科的黄病毒属(Alam A等:Recent trends in ZikV research:390 A step away from cure.Biomed Pharmacother 2017，91:1152
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1159)。寨卡病毒与黄热病毒(YFV)、登革热病毒(DENV)、日本脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)特征相似，在人类中引起轻度乃至严重危害生命的感染。2007年之前，在太平洋地区出现寨卡病毒感染暴发时，出现少数人感染病例(Gourinat AC等，Detection of Zika virus in urine[J].Emerg Infect Dis，2015，21(1):84
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6)。然而，从2015年，寨卡病毒横贯太平洋，在巴西引起100多万感染病例(Zanluca C等，First report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil[J].Mem Inst Oswaldo Cruz，2015，110(4):569
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72)。截至2019年5月，该病毒迅速传播到84个国家和地区，已经成为世界范围内的公共卫生问题(Hamelin ME等，Oseltamivir
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resistant pandemic A/H1N1 virus is as virulent as its wild
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type counterpart in mice and ferrets[J].PLoS Pathog，2010，6(7):e1001015)。针对ZIKV感染的方法包括开发疫苗和筛选抑制病毒生命周期(Batista MN等:Natural Products Isolated from Oriental Medicinal Herbs Inactivate Zika Virus.Viruses 2019，11)不同阶段的抗病毒药物。目前文献报道的大多数抗ZIKV活性先导化合物都进行了体外抗病毒活性测试，部分化合物也在动物模型上进行了体内抗病毒活性测试，仅有极少的候选化合物进入临床试验。尽管在过去几年中，研究人员在开发防治寨卡病毒感染的疫苗和抗病毒药物方面付出了艰苦的努力，但是仍没有疫苗或药物批准上市。
[0003]寨卡病毒是正义单链RNA病毒，感染宿主细胞，利用宿主细胞复制RNA基因组，进行组装再成为成熟的子代病毒，最后释放到细胞外。寨卡病毒作为一种RNA病毒，其具有高度的变异性，故针对其的药物设计是困难的，包括疫苗的设计、靶向试剂如基因编辑试剂的设计等，均会遭遇到因其高变性而导致的效果不理想的问题。
[0004]因此，确定适于进行寨卡病毒抑制的靶点是本领域的技术难题，本领域亟待找到合理合适的方式来解决这一问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于利用CRISPR的Cas13(如Cas13b)家族工具，提供一种基于CRISPR
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Cas13干预抑制寨卡病毒(ZIKV)在哺乳动物细胞中的复制的方法。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供crRNA在制备抑制寨卡病毒的组合物中的应用，所述crRNA针对寨卡病毒基因组，包括：(1)DR序列；以及，(2)选自SEQ ID NO:1～11任一所示序列(spacer)或序列组合。
[0007]在一种或多种实施方式中，(2)中，为选自SEQ ID NO:1～9任一所示序列或序列组合。
[0008]在一种或多种实施方式中，(2)中，为选自SEQ ID NO:1～5任一所示序列或序列组合。
[0009]在一种或多种实施方式中，所述的寨卡病毒包括表1和表2中所列举的任一病毒。
[0010]在一种或多种实施方式中，(2)的序列由引物退火形成。
[0011]在一种或多种实施方式中，(2)的序列由SEQ ID NO:17～38所示的引物退火形成。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供一种crRNA，包括：(1)DR序列；以及(2)选自SEQ ID NO:1～11任一所示序列或序列组合。
[0013]在一种或多种实施方式中，(2)的序列由引物退火形成。
[0014]在一种或多种实施方式中，(2)的序列由SEQ ID NO:17～38所示的引物退火形成。
[0015]在本专利技术的另一方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒含有所述crRNA。
[0016]在本专利技术的另一方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞含有所述crRNA或所述重组质粒。
[0017]在一种或多种实施方式中，所述的重组细胞包括真核细胞或原核细胞。
[0018]在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括(但不限于)：哺乳动物细胞(非人类哺乳动物细胞、人类细胞)、酵母、真菌细胞、昆虫细胞。
[0019]在一种或多种实施方式中，所述真核细胞包括：293T
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DC
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SIGN细胞。
[0020]在本专利技术的另一方面，提供一种CRISPR
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CAS复合物，其包括：Cas核酸酶；以及，所述的crRNA。
[0021]在一种或多种实施方式中，较佳地，所述Cas核酸酶包括Cas13核酸酶；较佳地，所述Cas13核酸酶包括Cas13a核酸酶或Cas13b核酸酶。
[0022]在一种或多种实施方式中，所述Cas核酸酶由质粒系统编码。
[0023]在一种或多种实施方式中，所述crRNA由质粒系统表达。
[0024]在一种或多种实施方式中，编码Cas核酸酶的质粒系统以pC0046
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EF1a
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PspCas13b
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NES
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HIV为骨架质粒；更佳地，所述骨架质粒中引入报告基因。
[0025]在一种或多种实施方式中，表达crRNA的质粒系统以pC0043
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PspCas13b
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crRNA
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backbone为骨架质粒。
[0026]在一种或多种实施方式中，所述Cas核酸酶的质粒系统或所述crRNA的质粒系统合并于一个质粒中或分置于不同的质粒中。
[0027]在本专利技术的另一方面，提供一种递送系统，其包含：所述的CRISPR
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CAS复合物或所述的重组质粒；及，递送载体。
[0028]在一种或多种实施方式中，所述递送载体包括选自(但不限于)：纳米颗粒、脂质体、微囊泡或基因枪本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.crRNA在制备抑制寨卡病毒的组合物中的应用，所述crRNA针对寨卡病毒基因组，包括：(1)DR序列；以及(2)选自SEQ ID NO:1～11任一所示序列或序列组合。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，(2)中，为选自SEQ ID NO:1～9任一所示序列或序列组合；更佳地，为选自SEQ ID NO:1～5任一所示序列或序列组合。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的寨卡病毒包括表1和表2中所列举的任一病毒。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，(2)的序列由引物退火形成；较佳地，(2)的序列由SEQ ID NO:17～38所示的引物退火形成。5.一种crRNA，其特征在于，包括：(1)DR序列；以及(2)选自SEQ ID NO:1～11任一所示序列或序列组合；较佳地，(2)的序列由引物退火形成；较佳地，(2)的序列由SEQ ID NO:17～38所示的引物退火形成。6.一种重组质粒或重组细胞，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求5所述的crRNA；或，所述重组细胞含有权利要求5所述的crRNA或所述重组质粒。7.一种CRISPR
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CAS复合物，其特征在于，其包括：Cas核酸酶；以及，权利要求5所述的crRNA；较佳地，所述Cas核酸酶包括Cas13核酸酶；较佳地，所述Cas13核酸酶包括Cas13a核酸酶或Cas13b核酸酶。8.如权利要求7所述的CRISPR
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CAS复合物，其特征在于，所述Cas核酸酶由质粒系统编码，所述crRNA由质粒系统表达。9.一种递送系统，其特征在于，其包含：权利要求7或8所述的CRISPR
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CAS复合物或权利要求6所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：