一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系、试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系、试剂盒及制备方法，所述的PCR试剂体系包括了无甘油Taq DNA聚合酶，本发明专利技术提供的制备方法能够有效提高冻干效果，能实现PCR体系中各组分在室温下的长期保存及稳定运输；以及包括检测生殖道三项病原体的三套引物和探针；所述的生殖道三项病原体分别为沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)和解脲脲原体(UU)，通过将3种病原微生物的检测集成在一管内，能同时检测生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体3种核酸，配制过程简单，反应重复性好，能够有效降低检测成本，提高检测效率。提高检测效率。提高检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系、试剂盒及制备方法


[0001]本专利技术是涉及基因片段检测
，具体地，涉及一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系、试剂盒及制备方法。

技术介绍

[0002]不孕症是指一年未采取避孕措施，性生活正常而未能成功妊娠的症状。研究表明，不孕症困扰着全球约16％的育龄夫妇。国内外的调查均表明，生物学因素中的输卵管因素是造成中国不孕症的首要因素。而生殖道病原体的感染是导致不孕不育的主要因素。其中沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和解脲脲原体是生殖道感染的主要病原菌，可引起男性尿道炎、女性阴道炎、宫颈炎、盆腔炎及不孕症等。
[0003]沙眼衣原体(CT)引起的性传播疾病是全世界近年来主要的导致不孕症的性传播疾病。CT感染的主要病理改变是慢性炎症，感染前期可能无明显临床症状，但是随着感染的发展，会引发组织损伤，后期还可形成瘢痕，对器官的正常功能造成影响。
[0004]淋病奈瑟菌(NG)为淋病的病原菌，可造成黏膜上皮的损伤，导致输卵管阻塞、粘连，从而影响黏膜上皮的正常分泌机制，导致不孕。淋病奈瑟菌性附睾
‑
睾丸炎可导致持续性的少精症、无精症。
[0005]解脲脲原体(UU)可在生殖道细胞表面形成黏附，对正常的细胞进行杀伤从而引起子宫内膜、输卵管慢性炎症的发生，输卵管黏膜遭到损伤后，会造成输卵管粘连或阻塞；另外，UU还对输卵管纤毛的运动造成一定的影响，阻碍受精卵的形成，从而导致不孕症的发生。
[0006]真空冷冻干燥技术是使混合物中已经冻结的固态冰不经融化成液态水的过程而直接升华成气态，最终去除水分并保留其他有效组分的新式高效干燥技术。
[0007]现有技术已有通过荧光PCR法设计检测生殖道三项病原体的特异性引物及探针，直接检测生殖道三项病原体核酸，灵敏度高、特异性好，操作简单且通过多重荧光PCR技术，能够在同一反应中检测生殖道三项病原体。荧光PCR反应的必要条件包括：荧光PCR反应缓冲系统、引物、探针、Taq酶、dNTP。结合真空冷冻干燥技术，保证PCR体系的长期保存和稳定运输。
[0008]目前现有技术存在的问题为：
[0009]现有技术的冻干效果较差，且配制过程繁琐，配制误差较大、反应重复性不好，产品储存及运输的成本较高。

技术实现思路

[0010]针对现有技术存在的不足，本专利技术第一目的是提供一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系，第二目的是提供一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂盒，第三目的是提供一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂盒的制备方法。
[0011]为了实现第一个目的，本专利技术通过如下技术方案实现。
[0012]一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系，所述PCR试剂体系包括以下组分：无甘油Taq DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、氯化钾、Tween
‑
20和Tris
‑
HCl；以及包括检测生殖道三项病原体的三套引物和探针；所述的生殖道三项病原体分别为沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)和解脲脲原体(UU)。
[0013]进一步的，沙眼衣原体(CT)的引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，沙眼衣原体的探针序列如SEQ ID NO.3所示；
[0014]淋病奈瑟菌(NG)的引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物如SEQ ID NO.5所示，淋病奈瑟菌的探针序列如SEQ ID NO.6所示；
[0015]解脲脲原体(UU)的引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物如SEQ ID NO.8所示，解脲脲原体的探针序列如SEQ ID NO.9所示。
[0016]进一步的，还包括人源内参基因的引物对和管家基因的探针，人员内参基因引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物如SEQ ID NO.11所示，管家基因探针序列如SEQ ID NO.12所示。
[0017]进一步的，所述的4个探针的5
’
端均标记有荧光基团：
[0018]沙眼衣原体探针的5
’
端标记有FAM荧光基团；淋病奈瑟菌探针的5
’
端标记有ROX荧光基团；解脲脲原体探针得5
’
端均标记有CY5荧光基团；人源内参基因探针的5
’
端标记有VIC荧光基团。
[0019]为了实现第二个目的，本专利技术通过如下技术方案实现。
[0020]一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂盒，包括上述PCR试剂体系以及冻干保护剂。
[0021]进一步的，所述的冻干保护剂由0.4％～3％甘露醇，2％～12％海藻糖，0.3～2.5mg/mL BSA蛋白，0.6％～2％PEG 6000组成。
[0022]为了实现第三个目的，本专利技术通过如下技术方案实现。
[0023]一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂盒，其制备方法如下：
[0024]S1：配制液体PCR试剂：将三项病原体的三套引物对和探针、人源内参基因的引物对和管家基因的探针、无甘油Taq DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、氯化钾、Tween
‑
20和Tris
‑
HCl混合，并加入适量冻干保护剂。
[0025]S2：将S1中制备的液体PCR试剂冻干，获得冻干PCR试剂。
[0026]进一步的，三套引物探针组中的引物在扩增体系中的终浓度均为100
‑
1000nM；所述引物探针组中的探针在扩增体系中的终浓度均为50
‑
500nM。
[0027]进一步的，所述检测样本包括咽拭子。
[0028]本专利技术的有益效果：
[0029]本专利技术通过在试剂盒的PCR体系中加入无甘油Taq DNA聚合酶，能够有效提高冻干效果，能实现PCR体系中各组分在室温下的长期保存及稳定运输。
[0030]本专利技术提供的制备方法配置过程简单，配制误差小，反应重复性好，有利于降低产品储存及运输成本。
[0031]本专利技术提供的用于检测生殖道三项病原体的三套引物和探针，具有较高的灵敏度，通过将3种病原微生物的检测集成在一管内，能同时检测生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟
菌、解脲脲原体3种核酸，能够有效降低检测成本，提高检测效率。
附图说明
[0032]图1为试剂冻干后的图片；
[0033]图2为本试剂冻干前后检测沙眼衣原体的性能对比图；
[0034]图3为本试剂冻干前后检测淋病奈瑟菌的性能对比图；
[0035]图4为本试剂冻干前后检测解脲脲原体的性能对比图；
[0036]图5的a组和b组分别为实施例1与对比例1制备的试剂冻干后的状态图；
[0037]图6为不同浓度梯度下冻干试剂重复性对比图。
具体实施方式
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系，其特征在于：所述PCR试剂体系包括以下组分：无甘油Taq DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、氯化钾、Tween
‑
20和Tris
‑
HCl；以及包括检测生殖道三项病原体的三套引物和探针；所述的生殖道三项病原体分别为沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)和解脲脲原体(UU)。2.根据权利要求1所述的用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系，其特征在于：沙眼衣原体(CT)的引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，沙眼衣原体的探针序列如SEQ ID NO.3所示；淋病奈瑟菌(NG)的引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物如SEQ ID NO.5所示，淋病奈瑟菌的探针序列如SEQ ID NO.6所示；解脲脲原体(UU)的引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物如SEQ ID NO.8所示，解脲脲原体的探针序列如SEQ ID NO.9所示。3.根据权利要求2所述的用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系，其特征在于：还包括人源内参基因(IC)的引物对和管家基因的探针，人员内参基因(IC)引物对中上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物如SEQ ID NO.11所示，管家基因探针序列如SEQ ID NO.12所示。4.根据权利要求3所述的用于生殖道三项病原体核酸检测的PCR试剂体系，其特征在于：所述的4个探针的5
’
端均标记有荧光基团：沙眼衣原体探针的5
’
端标记有FAM荧光基团；淋病奈瑟菌探针的5
’
端标记有ROX荧光基团；解脲脲原体探针得5
’
端均标...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵子晨，迟翔宇，吴冰，于绍斌，
申请(专利权)人：天津威高分子诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：