同时检测多种病原的多重LAMP引物组、检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组、检测方法和试剂盒，属于微生物检测领域。所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测引物组如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
同时检测多种病原的多重LAMP引物组、检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于病原检测
，具体地涉及一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组、检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]石斑鱼是属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)的一类鱼类的总称。其中病毒性疾病及细菌性疾病是石斑鱼疾病的重要类型。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是感染石斑鱼的主要病毒之一，常给石斑鱼养殖业造成严重的经济损失。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是石斑鱼常见的弧菌属病原菌，也可严重威胁卵形鲳鲹、对虾等其他重要水产动物的健康。并且，近年来石斑鱼经常出现被多种病原体同时感染的现状，因此加强病原的早期快速诊断和大范围筛查，研发多种病原同时检测的多目标检测手段迫在眉睫。
[0003]为了应对近年出现的一种水生动物被多种病原体同时感染的现状，多重LAMP技术应运而生，该技术既具有LAMP技术时间短、操作简单、敏感性和特异性高、产物可视化等优点，还可以实现多种病原的同时检测，大大缩短了多病原单一检测的时间，是一种比较有前景的多目标快速检测技术。目前多重LAMP检测技术已经在多种哺乳动物疾病核酸检测中使用。虽然多重LAMP技术拥有如此多的优势，但其在水生动物病原快速检测方面的研究尚处于起步阶段，已有的研究仍主要集中在对虾病原多目标快速检测方面。多重LAMP技术在石斑鱼病原多目标快速检测方面仍存在很大空白，可同时检测石斑鱼三种重要病原(石斑鱼虹彩病毒、哈维氏弧菌和副溶血弧菌)的多目标检测技术更是从未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可同时检测哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，且特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。
[0005]本专利技术利用环介导等温扩增技术，以哈维氏弧菌的Toic基因(GenBank登录号为APP06536.1)、副溶血弧菌的DNAJ基因(GenBank登录号为AWA88525.1)及石斑鱼虹彩病毒的RAD2基因(GenBank登录号为YP_164192.1)为特异靶基因，设计、筛选并优化特异性引物，建立一种多重LAMP检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性对照组和阴性对照组，并通过钙黄绿素显色法和凝胶电泳分析检测样品组和其他两组对照的扩增产物来判断样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，以达到方便简单，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本专利技术的目的。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测引物组如SEQ ID NO.1
‑
18，具体序列如下：
[0007]VH
‑
F3：5
’‑
TCCTTCGAGTTTCTCAAGCG
‑3’
，
[0008]VH
‑
B3：5
’‑
TCACGTAGCGATTCGTAGCT
‑3’
；
[0009]VH
‑
FIP：
[0010]5’‑
CTAGTTGGCGACCAACCGCTCGCGCACAAGACAACCTAG
‑3’
，
[0011]VH
‑
BIP：
[0012]5’‑
TCACTGACGTACACGATGCGCCGAGTTTTCCGCCAAGACT
‑3’
；
[0013]VH
‑
LF：5
’‑
GCTTTTTCTGCACGAACGAA
‑3’
，
[0014]VH
‑
LB：5
’‑
AAGCACAATACGATGCAGTACTTG
‑3’
；
[0015]VP
‑
F3：5
’‑
GTCTATCTGGCGAAGGCG
‑3’
，
[0016]VP
‑
B3：5
’‑
ACATACGGCCAGTTTGTGTT
‑3’
；
[0017]VP
‑
FIP：5
’‑
TTGCCGTCACGCTCGAAAATGTGAAATGGGTGCACCATCAGG
‑3’
[0018]VP
‑
BIP：5
’‑
AGCTTTGCTATGGCTGCACTCGCTGACGGCACTTTTAGGCT
‑3’
；
[0019]VP
‑
LF：5
’‑
TGCTCTTTCACGTGTACTTGTACG
‑3’
，
[0020]VP
‑
LB：5
’‑
GAAGTTGAAGTTCCAACACTTGATG
‑3’
；
[0021]SGIV
‑
F3：5
’‑
AGGGACTGAAGCTGTTGCT
‑3’
，
[0022]SGIV
‑
B3：5
’‑
GGATCGCCGTCAAACACAA
‑3’
；
[0023]SGIV
‑
FIP：5
’‑
AGGGTCTTGCCGGAGAGCTTCAAGAGTTCAGGTGTGGAGG
‑3’
[0024]SGIV
‑
BIP：5
’‑
ACACACAGCGTGGCAGTATCTGATAGCGTTTACGCGCCTC
‑3’
；
[0025]SGIV
‑
LF：5
’‑
GTTTAGGCACACCGTAAAAT
‑3’
，SGIV
‑
LB：5
’‑
TACTGTTTATGCTGTGTTGCCTCA
‑3’
；
[0026]本专利技术的第二个目的是提供多重LAMP引物组在同时检测多种病原中的应用，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测为非疾病诊断和治疗的目的。
[0027]本专利技术的第三个目的是提供多重LAMP引物组在同时检测多种病原试剂盒中的应用，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
[0028]进一步，所述试剂盒包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、含MnCl2的钙黄绿素显色液、阳性对照质控品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组，其特征在于，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的多重LAMP引物组如SEQ ID NO.1
‑
18所示。2.权利要求1所述多重LAMP引物组在同时检测多种病原中的应用，其特征在于，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测为非疾病诊断和治疗的目的。3.权利要求1所述多重LAMP引物组在同时检测多种病原试剂盒中的应用，其特征在于，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。4.根据权利要求3所述多重LAMP引物组在同时检测多种病原试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、含MnCl2的钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和多重LAMP引物组；所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。5.根据权利要求4所述多重LAMP引物组在同时检测多种病原试剂盒中的应用，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含哈维氏弧菌的Toic基因的质粒DNA、副溶血弧菌的DNAJ基因的质粒DNA及石斑鱼虹彩病毒的RAD2基因的质粒DNA的混合液；所述的阴性对照质控品为超纯水。6.一种同时检测多种病原的多重LAMP检测方法，其特征在于，所述方法非疾病诊断和治疗目的，所述的病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述方法具体包括以下步骤：(1)对样品进行收集，使用病毒和细菌DNA提取试剂盒提取病毒和细菌的基因组DNA，等比例混合后作为LAMP反应的模板；(2)使用权利要求1所述的多重LAMP引物组，与环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、含MnCl2的钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和或凝胶电泳分析检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有哈维氏弧菌、副溶血...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹贞洁，孙云，周永灿，李涛，吴莹，杜和禾，郭伟良，王世锋，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：