检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒和方法，所述引物包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的引物和用于检测金黄色葡萄球菌nuc基因的引物。在本发明专利技术中，首先优化了待测样本的DNA提取方法，使能尽可能富集和保留长片段，再通过采用针对金黄色葡萄球菌nuc基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA设计的特异性扩增引物，靶向扩增nuc基因和mecA基因，经纳米孔测序，测序长度可达2000～3000bp，更加完整覆盖耐药基因，提高了耐药基因的检测灵敏度，且4～6小时即可完成测序，实现了实时、快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。氧西林金黄色葡萄球菌。氧西林金黄色葡萄球菌。

【技术实现步骤摘要】
检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，更具体地，本专利技术涉及一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是临床上常见的毒性较强的细菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，是葡萄球菌属的一种，多种动物和人均有易感性。随着抗菌药物的使用，逐渐出现耐药型金黄色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin
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resistantstaphylococcusaureus,MRSA)。MRSA具有多重耐药性，不仅对β
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内酰胺类抗菌药物耐药，也对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类和喹诺酮类药物都表现出不同程度的耐药，开展对MRSA的检测，对于控制医院内感染的流行，指导临床治疗有着十分重要的意义。
[0003]mecA基因是MRSA特有的耐药性遗传决定子，编码产生β
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内酰胺类抗菌药物低亲和力的PBP2a，从而使细菌产生耐药性。nuc基因仅特异地存在于金黄色葡萄球菌中，mecA基因测定是检测耐甲氧西林葡萄球菌的快速简易手段。两者联合可用来筛选MRSA。
[0004]目前MRSA检测的主要方法有：(1)、苯唑西林—盐平板筛选法、纸条扩散法和E实验：使用自动分析仪检测MRSA，方法简单，但因其存在一定偏差，对敏感性与已知菌株不同者需用其他方法重新鉴定。(2)、PCR方法：通过直接检测细菌染色体上的mecA基因来确定被检细菌是否为耐甲氧西林菌株，不受药敏实验的干扰，但是通量低，一次仅能检测1个样本或少量的靶标，扩增片段较短(＜1000bp)；(3)、二代测序：一次性无偏倚的检测样本中所有病原体，通量高，但是测序时间长(24h)，且测序长度仅能达到300～500bp，无法完全覆盖耐药基因，耐药基因检测灵敏度不够，不利于耐药基因检测。
[0005]因此，提供一种灵敏度更高的MRSA检测方法非常有必要。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的在于提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒及方法。
[0007]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0008]本专利技术的第一个方面，是提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物，包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的引物1和引物2，和用于检测金黄色葡萄球菌nuc基因的引物3和引物4；所述引物1包括SEQ ID NO.9所示的正向引物和SEQ ID NO.10所示的反向引物；所述引物2包括SEQ IDNO.11所示的正向引物和SEQ ID NO.12所示的反向引物；所述引物3包括SEQ ID NO.13所示的正向引物和SEQ ID NO.14所示的反向引物；所述引物4包括SEQ ID NO.15所示的正向引物和SEQ ID NO.16所示的反向引物。
[0009]本专利技术的第二个方面，是提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，所
述试剂盒包括上述引物。
[0010]本专利技术的第三个方面，是提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括步骤：使用上述引物对待测样本的DNA进行第一轮PCR扩增后，再使用Index引物进行第二轮扩增，构建测序文库，进行纳米测序。
[0011]在本专利技术中，首先优化了待测样本的DNA提取方法，使能尽可能富集和保留长片段，再通过采用针对金黄色葡萄球菌nuc基因和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA设计的特异性扩增引物，靶向扩增nuc基因和mecA基因，经纳米孔测序，测序长度可达2000～3000bp，更加完整覆盖耐药基因，提高了耐药基因的检测灵敏度，且4～6小时即可完成测序，实现了实时、快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
附图说明
[0012]图1为本专利技术试验例3中采用不同的DNA提取方案对测序结果的影响。
具体实施方式
[0013]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0014]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0015]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，公开了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物，包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的引物1和引物2，和用于检测金黄色葡萄球菌nuc基因的引物3和引物4；所述引物1，包括SEQ ID NO.9所示的正向引物和SEQ ID NO.10所示的反向引物；所述引物2，包括SEQ ID NO.11所示的正向引物和SEQ ID NO.12所示的反向引物；所述引物3，包括SEQ ID NO.13所示的正向引物和SEQ ID NO.14所示的反向引物；所述引物4，包括SEQ ID NO.15所示的正向引物和SEQ ID NO.16所示的反向引物。
[0017]在本专利技术的另一些实施例中，公开了上述引物在制备检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒中的应用。
[0018]在本专利技术的另一些实施例中，公开了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物。
[0019]在其中一些实施例中，所述引物的工作浓度均为400nM～800nM。
[0020]在其中一些实施例中，所述引物3、引物4、引物1和引物2的正向引物和反向引物的浓度比均为1：1。
[0021]在其中一些实施例中，所述引物3、引物4、引物1和引物2的工作浓度比为0.8～
1.2：0.8～1.2：1.2～1.8：1.8～2.2。作为优选的，引物3的工作浓度为400nM，引物4的工作浓度为400nM，引物1的工作浓度为600nM，引物2的工作浓度为800nM。
[0022]在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括Index引物。
[0023]在本专利技术的另一些实施例中，公开了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：使用检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物对待测样本的DNA进行第一轮PCR扩增后，再使用Index引物进行第二轮扩增，构建测序文库(所有样本等本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物，其特征在于，包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的引物1和引物2，和用于检测金黄色葡萄球菌nuc基因的引物3和引物4；所述引物1包括SEQ ID NO.9所示的正向引物和SEQ ID NO.10所示的反向引物；所述引物2包括SEQ ID NO.11所示的正向引物和SEQ ID NO.12所示的反向引物；所述引物3包括SEQ ID NO.13所示的正向引物和SEQ ID NO.14所示的反向引物；所述引物4包括SEQ ID NO.15所示的正向引物和SEQ ID NO.16所示的反向引物。2.权利要求1所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物在制备检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒中的应用。3.一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物。4.根据权利要求3所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，所述引物的工作浓度均为400nM～800nM。5.根据权利要求4所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，所述引物3、引物4、引物1和引物2的正向引物和反向引物的工作浓度比均为1：1。6.根据权利要求5所述的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于，所述引物3、引物4、引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：余艳，许寻寻，唐春燕，谭兵健，葛虎，代冰，苏洁琼，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：