猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括探针、正向引物、反向引物、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照，探针序列如SEQ ID NO.13所示；本发明专利技术提供的一种猫衣原体核酸快速检测试剂盒，通过利用RAA技术结合荧光探针技术，建立猫衣原体的实时荧光RAA检测试剂盒，实现对猫衣原体核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单等优势。本发明专利技术试剂盒建立的检测方法灵敏度高于荧光PCR，检测限可达5.3copies/μL，满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求。现场核酸检测的要求。现场核酸检测的要求。

【技术实现步骤摘要】
猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]在猫的传染性疾病中，猫的上呼吸道感染最为普遍，其致病原包括：病毒(疱疹病毒、杯状病毒等)、细菌(绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、波氏杆菌等)、支原体、衣原体和真菌(隐球菌、孢子丝菌)等。在临床上常见的有疱疹病毒、杯状病毒、支原体、衣原体和波氏杆菌病，其中最容易传染人，并能造成人感染发病的人兽共患病病原为衣原体。衣原体具有广泛的致病性，是一种重要的人兽共患病，能引起人和动物的多种疾病。衣原体科有衣原体属及亲衣原体属两个属。衣原体属(Chlamydia)的成员有：沙眼衣原体(C.trachematis)、鼠衣原体(C.muri darum)及猪衣原体(C.suis)；亲衣原体属(Chlamydophilia)的成员有：牛羊亲衣原体(Cp.pecorum，原为肺炎衣原体)、肺炎亲衣原体(Cp.pneumenice)、鹦鹉热亲衣原体(Cp.psittaci)、流产亲衣原体(Cp.abertus)、猫亲衣原体(Cp.felis)、豚鼠亲衣原体(Cp.caviae)。猫亲衣原体(Cp.felis)原为鹦鹉热亲衣原体猫源株，是由Baker(1942)等人首先报道的，是从患有肺炎的猫体中分离到鹦鹉热衣原体(Chamydia Psittaci)，以后许多学者也从猫体中分离到此种病原，这些病原统称为猫衣原体(C.felis)，并且证实C.felis可引起猫的多种疾病，可致猫结膜炎及鼻炎，也可致肺炎，有可能与胃肠炎及生殖系统疾病有关。感染C.felis的病猫可将衣原体传染于人，给公共卫生安全和人的健康造成危害。
[0003]目前尚无高效的猫衣原体疫苗用于预防。因此，及时发现并掌握猫衣原体的流行现状及感染情况对控制该病的传播和制定治疗措施十分关键。现阶段针对猫衣原体的检测方法主要有病原分离培养法、免疫学方法和核酸检测法等。其中，病原分离培养法存在操作复杂、耗时长、仪器设备及操作人员要求高等缺点，不适合早期、现场快速诊断；免疫学方法是使用较为常见的一种技术，但这种方法前提条件是需制备高质量的抗原或特异性抗体，致使检测易出现假阴性或假阳性结果；常见的检测方法是基于核酸的分子检测方法，其中荧光PCR技术比较常见，是当前病原检测的金标准，但该方法需要昂贵的设备和专业的操作人员，而且一般需要两个小时以上的检测时长，很难满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求，且灵敏度和特异性难以让人满意。本专利技术在重组酶介导等温核酸扩增(recombinant enzyme mediated isothermal nucleic acid amplification，RAA)技术的基础上，进而借助荧光探针技术高灵敏性优势，建立猫衣原体荧光RAA检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术中的不足，目的是提供一种猫衣原体荧光RAA检测试剂盒及检测方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：
[0006]一种猫衣原体荧光RAA检测试剂盒，其包括探针、正向引物、反向引物、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照，探针序列如SEQ ID NO.13所示。
[0007]优选地，正向引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示；
[0008]反向引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12所示。
[0009]优选地，缓冲液包括2.5mmol/L dNTPs、225ng/μL SSB、300ng/μL recA重组酶蛋白(SC
‑
recA/BS
‑
recA)和75ng/μL Bsu DNA聚合酶。
[0010]优选地，阳性对照为C.felis_pUC57质粒，阴性对照为双蒸水。
[0011]优选地，猫衣原体荧光RAA检测试剂盒的检测体系为：正向引物和反向引物的浓度为10μM，体积为2μL，探针的浓度为10μM，体积为0.6μL，缓冲液的体积为25μL，醋酸镁的浓度为280mM，体积为5μL，阳性对照和阴性对照的体积为50μL。
[0012]一种利用上述的猫衣原体荧光RAA检测试剂盒的检测方法，其包括如下步骤：
[0013](1)、针对靶向序列设计引物对，并稀释；
[0014](2)、将稀释后的引物对和靶向序列加入猫衣原体荧光RAA检测试剂盒的检测体系中等温扩增，将扩增产物与酚氯仿进行等体积混合，离心，上清液进行凝胶电泳。
[0015]优选地，步骤(1)中，靶向序列如SEQ ID NO.14所示。
[0016]优选地，步骤(1)中，引物对的序列如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.12所示。
[0017]优选地，步骤(2)中，离心的转速为5 000rmp，时间为5min。
[0018]由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：
[0019]本专利技术提供的一种猫衣原体核酸快速检测试剂盒，通过利用RAA技术结合荧光探针技术，建立C.felis的实时荧光RAA检测试剂盒，实现对猫衣原体核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单等优势。猫衣原体常用的检测方法为荧光PCR，其检测限达10copies/μL，本专利技术试剂盒建立的检测方法灵敏度高于荧光PCR，检测限可达5.3copies/μL。
[0020]本专利技术提供的一种利用猫衣原体核酸快速检测试剂盒检测猫衣原体核酸的方法，在恒温条件下，全程1h内就能完成样品核酸提取以及检测。满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求。
附图说明
[0021]图1为专利技术实施例4中不同引物对普通RAA检测结果。
[0022]图2为专利技术实施例4中引物对C.felis1F/C.felis1R普通RAA扩增产物测序后BLAST结果。
[0023]图3为专利技术实施例7中不同引物对荧光RAA检测结果。
[0024]图4为专利技术实施例8中实时荧光RAA敏感性检测结果。
[0025]图5为专利技术实施例9中实时荧光RAA特异性检测结果。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种猫衣原体荧光RAA检测试剂盒及检测方法。
[0027]提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，并不局限于所述最佳实施方式，不对本专利技术的内容和保护范围构成限制，任何人在本专利技术的启示下或是将本专利技术与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本专利技术相同或相近似的产品，均落在本专利技术的保护范围之内。
[0028]实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：其包括探针、正向引物、反向引物、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照，所述探针序列如SEQ ID NO.13所示。2.根据权利要求1所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述正向引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示；所述反向引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12所示。3.根据权利要求1所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液包括2.5mmol/L dNTPs、225ng/
µ
L SSB、300ng/
µ
L recA重组酶蛋白（SC
‑
recA/BS
‑
recA）和75 ng/
µ
L Bsu DNA聚合酶。4.根据权利要求1所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为C. felis_pUC...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵洪进，刘健，钱卫东，桂亚萍，白艺兰，王建，王晓旭，徐锋，沈莉萍，龚国华，李增强，常晓静，陶田谷晟，沈海潇，
申请(专利权)人：上海市动物疫病预防控制中心上海市兽药饲料检测所，上海市畜牧技术推广中心，
类型：发明
国别省市：