一种基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法技术

本发明专利技术提供一种基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法，采用靶向扩增高通量测序技术，基于Illumina Miseq测序平台，构建了采用16S rRNA宏基因组测序进行细菌检测和包含12类常用抗生素134个抗生素耐药基因panel的整合检测方法，实现同时对样本中的细菌种属和12类抗生素的134个耐药基因进行检测，以明确耐药基因是否为细菌来源。本发明专利技术所述检测方法操作简单、便捷、快速、省时省力，通过两步PCR法进行文库构建，先经多重PCR扩增对细菌16S rRNA及耐药基因目的区域进行富集，再采用常规PCR进行文库扩增。可在24小时内完成从原始样本到测序数据全部步骤，且检测成本较低。低。低。

【技术实现步骤摘要】
一种基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法。

技术介绍

[0002]细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大问题之一，对人类公共健康的威胁日益严重。通过对细菌耐药的检测，有效、合理的使用抗生素，减少抗生素的滥用、误用是遏制细菌耐药日益恶化的重要手段之一。
[0003]细菌耐药常规检测的方法主要有表型药敏试验、PCR检测、基因芯片、MALDI
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TOF MS等，该类方法检测通量较低、部分检测时间较长、成本较高。近年来，基于高通量测序的WGS、mNGS开始逐步应用于感染性疾病含细菌耐药检测领域。WGS检测培养纯菌株的全基因组序列，可发现新的耐药基因、机制，但检测周期较长、检测通量低、对无法培养、具有开放基因组的菌种无法进行检测。mNGS虽可无偏差的检测原始样本中微生物组中的核酸序列，但会受样本背景核酸的影响，测序数据中会存在大量背景核酸序列，所需的测序数据量大导致成本较高、检测灵敏度低、对低含量的微生物和耐药基因无法检出。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法。本专利技术采用靶向扩增高通量测序技术，基于Illumina Miseq测序平台，构建了采用16S rRNA宏基因组测序进行细菌检测和包含12类常用抗生素134个抗生素耐药基因panel的整合检测方法。
[0005]本专利技术所采用的技术方案为：一种基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法，包括如下步骤：（1）提取待测细菌的基因组DNA；（2）以步骤（1）提取到的基因组DNA为模板，对待测细菌的16S rRNA和耐药基因进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；（3）对步骤（2）所得多重PCR扩增产物进行PCR扩增，以构建文库；（4）对所述文库进行测序，得到测序结果。
[0006]步骤（1）中，所述待测细菌包括幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K. pneumonia)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, A. baumannii)、(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, S. epidermidis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae, S. agalactiae)中的至少一种。
[0007]步骤（1）中，对所述待测细菌的基因组DNA的提取步骤如下：（S1）取1mL细菌培养液于1.5mL离心管中，高速离心1 min，采用移液器缓慢吸取上清液后弃去；向仅含沉淀菌液的1.5mL离心管中缓慢加入200μL缓冲液GA，置于振荡器上剧
烈震荡至菌液全部重悬混匀；（S2）加入20μL 蛋白酶 K，混匀，瞬离；加入220μL缓冲液GB，振荡15s充分混匀，70℃孵育10min，瞬离；（S3）加入220μL无水乙醇，振荡15s充分混匀，瞬离；将所有液体转入放在收集管上的吸附柱中，高速离心30s，收集管中的废液全部弃去，收集管重复使用；（S4）采用移液器吸取500μL的GD缓冲液缓慢加入吸附柱中，高速离心30s，收集管中的废液全部弃去，收集管重复使用；（S5）采用移液器吸取600μL的PW漂洗液加入吸附柱中，高速离心30s，收集管中的废液全部弃去；重复一次，重复离心后收集管同废液一同弃去；（S6）将离心后的吸附柱放置于新的收集管上，12000 rpm离心2min；将吸附柱转至新的1.5mL离心管上，开盖，室温放置5min；（S7）加入50μL的洗脱缓冲液，室温静置2min；12000 rpm离心2min；（S8）采用紫外分光光度计进行提取DNA纯度和浓度的测定。
[0008]步骤（2）中，选择16S rRNA的V4高变区进行细菌的鉴定；所述16S rRNA检测的引物对设计为520F/802R。
[0009]所述耐药基因panel靶标基因为12大类抗生素的134个耐药基因，耐药基因检测的引物为多重PCR panel引物。
[0010]所述12大类抗生素包括β
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内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、诺喹酮类、多肽类、万古霉素类、林可霉素类、大环内酯类、链阳霉素类、甲氧苄啶类和林可霉素
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大环内酯
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链阳霉素类。
[0011]步骤（2）中，所述多重PCR反应体系如下：试剂组分单反应用量(μL)2
×
多重PCR MasterMix15耐药基因panel引物7模板DNA8总体积30步骤（2）中，所述多重PCR反应条件如下：
[0012]步骤（3）中，构建文库时，PCR反应体系如下：
[0013]步骤（4）中，采用Illumina Miseq平台双端测序模式进行所述文库的序列测定。
[0014]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法，采用靶向扩增高通量测序技术，基于Illumina Miseq测序平台，构建了采用16S rRNA宏基因组测序进行细菌检测和包含12类常用抗生素134个抗生素耐药基因panel的整合检测方法，本专利技术方法能够实现同时对样本中的细菌种属和12类抗生素的134个耐药基因进行检测，以明确耐药基因是否为细菌来源。本专利技术所述检测方法操作简单、便捷、快速、省时省力，通过两步PCR法进行文库构建，先经多重PCR扩增对细菌16S rRNA及耐药基因目的区域进行富集，再采用常规PCR进行文库扩增。可在24小时内完成从原始样本到测序数据全部步骤，整体人工操作时间大概2小时。且检测成本较低，批次检测平均每例样本检测成本350元左右。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1是本专利技术所述检测方法的具体流程图。
具体实施方式
[0017]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。
[0018]下述实施例中采用的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)培养菌株和临床样本肺炎克雷伯(Klebsiella pneumoniae,K. pneumonia)分离株为专利技术人实验室留存培养菌株。鲍曼不动杆菌((Ac本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取待测细菌的基因组DNA；（2）以步骤（1）提取到的基因组DNA为模板，对待测细菌的16S rRNA和耐药基因进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；（3）对步骤（2）所得多重PCR扩增产物进行PCR扩增，以构建文库；（4）对所述文库进行测序，得到测序结果。2.根据权利要求1所述的基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述待测细菌包括幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K. pneumonia)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, A. baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, S. epidermidis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae, S. agalactiae)中的至少一种。3.根据权利要求1所述的基于靶向高通量测序的细菌及耐药基因的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述待测细菌的基因组DNA的提取包括如下步骤：（S1）取1mL细菌培养液于1.5mL离心管中，高速离心1 min，采用移液器缓慢吸取上清液后弃去；向仅含沉淀菌液的1.5mL离心管中缓慢加入200μL缓冲液GA，置于振荡器上剧烈震荡至菌液全部重悬混匀；（S2）加入20μL 蛋白酶 K，混匀，瞬离；加入220μL缓冲液GB，振荡15s充分混匀，70℃孵育10min，瞬离；（S3）加入220μL无水乙醇，振荡15s充分混匀，瞬离；将所有液体转入放在收集管上的吸附柱中，高速离心30s，收集管中的废液全部弃去，收集管重复使用；（S4）采用移液器吸取500μL的GD缓冲液缓慢加入吸附柱中，高速离心30s，收集管中的废液全部弃去，收集管重复...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，刘琪琦，陈慧娟，周喆，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：