一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合。所述引物组合包括ARMs

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合。

技术介绍

[0002]幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，HP)是存在于胃及十二指肠的一种螺旋状革兰氏阴性菌，在寄生过程中所产生的毒素会对胃粘膜造成损害，进而会引起一系列的胃部疾病，四联疗法是当前国内外公认的一线治疗幽门螺旋杆菌的方法，其中抗生素的治疗是非常重要的一环节，但由于幽门对多种抗菌药物耐药，导致幽门根治率较低，随着人们对细菌耐药性研究的深入，有研究表明大多数幽门螺旋杆菌菌株对这些抗生素的耐药是由突变引起的。
[0003]目前，国内针对幽门耐药突变检测方法学主要有实时定量PCR、ARMs
‑
PCR法、测序法、导流杂交法、熔解曲线法。实时定量PCR法虽操作简单，可用于检测产物长度低于300bp的反应，但其检测通道有限，且易出现非特异性扩增；ARMS
‑
PCR虽能提高特异性能，可检测低至1％的突变，但其检测通量较低；NGS技术虽具有通量高，灵敏度高等优势，但基于NGS进行SNP基因型的分型鉴定，存在设备昂贵，且PCR扩增产物需要开盖处理，极易造成室内气溶胶污染，影响结果的准确性等问题；导流杂交法虽检测通量较高，但其需多管PCRmix才能满足幽门较多突变类型的检测，操作繁琐，其原理依赖于显色反应，实验结果主观性强。韩国Seegene公司的TOCE
TM
技术对于四色荧光通道，在单管中便可检测20个靶标，其中DPO
TM
引物的独特结构，可避免形成引物二聚体和复杂的二级结构、防止多重靶标引物间的竞争，实现单个反应中多靶标扩增时的等效性和同步性，因此DPO
TM
技术特别适用于单管多重核酸检测，
[0004]CN114836555A公开了用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法，所述方法将DPO
TM
引物成功应用于幽门耐药检测，但该方法主要基于PCR平台，通量有限，且DPO引物中独特的哑铃结构，虽能降低非特异性扩增的可能性，但存在3
’
端有时无法延伸扩增的问题。
[0005]CN114908178A公开了一种幽门螺杆菌四环素耐药的高分辨溶解曲线检测方法及试剂盒，所述方法针对猪螺杆菌的特异基因分析，设计了一对高分辨溶解曲线引物，引物长度在15
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30bp之间，引物本身无发卡结构，所扩展产物长度适中，引物不但可以用于检测幽门螺杆菌菌株，也可以直接用于实际样本胃粘膜。
[0006]CN114410811A公开了检测或鉴定幽门螺杆菌耐药基因突变的方法、引物探针组合物、应用、试剂盒及使用方法，引物探针组合物包括ARMS引物探针组合物和其它序列特异性引物探针组合物，ARMS引物探针组合物用于扩增目标突变基因，其它序列特异性引物探针组合物用于扩增其它序列或基因，通过计算目标突变基因与其它序列的Ct值的差值判断幽门螺杆菌耐药基因突变结果能够实现一管即可完成多个位点突变的检测，具有高效、高通量的优势。
[0007]综上所述，目前检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的方法存在通量有限，特异性低，难以优化等问题。如何实现一步法检测多个靶标多个突变位点，提高特异性，已成为目前生物
亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合，解决了现有检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的方法存在的通量有限，特异性低，难以优化等问题。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合，所述引物组合包括ARMs
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桥联引物和媒介引物；
[0011]所述ARMs
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桥联引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示序列，所述媒介引物的核酸序列包括SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.37所示序列，所述探针的核酸序列包括SEQ ID NO.38～SEQ ID NO.54所示序列。
[0012]本专利技术创造性地设计了用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的ARMs
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桥联引物组合、媒介引物和荧光探针，不受检测通道的限制，可实现单管多个靶标、多个突变位点的检测，提高了特异性，结果准确，数据可靠。
[0013]SEQ ID NO.1：TTGTAGTAAAGGTCCACGGG(I)nGTCTTT。
[0014]SEQ ID NO.2：TGTAGTAAAGGTCCACGGG(I)nGTCTTC。
[0015]SEQ ID NO.3：CTAAGTTGTAGTAAAGGTCCACGG(I)nGGTCTT。
[0016]SEQ ID NO.4：TAAGTTGTAGTAAAGGTCCACGGG(I)nGTCTC。
[0017]SEQ ID NO.5：CTAAGTTGTAGTAAAGGTCCACG(I)nGGGTCT。
[0018]SEQ ID NO.6：CTAAGTTGTAGTAAAGGTCCACG(I)nGGGTCC。
[0019]SEQ ID NO.7：CCCATGGCGATAATGCGG(I)nTTTATG。
[0020]SEQ ID NO.8：CCCATGGCGATAATGCGG(I)nTTTATT。
[0021]SEQ ID NO.9：CCCATGGCGATAATGCGG(I)nTTTATA。
[0022]SEQ ID NO.10：CCATGGCGATAATGCGGT(I)nTTATGA。
[0023]SEQ ID NO.11：CCATGGCGATAATGCGGT(I)nTTATGC。
[0024]SEQ ID NO.12：TGGAGCATGTGGTTTAATT(I)nCGAAGA。
[0025]SEQ ID NO.13：TGGAGCATGTGGTTTAATT(I)nCGAAAG。
[0026]SEQ ID NO.14：TGGAGCATGTGGTTTAATT(I)nCGAAGG。
[0027]SEQ ID NO.15：TGGAGCATGTGGTTTAATT(I)nCGAACG。
[0028]SEQ ID NO.16：TGGAGCATGTGGTTTAATT(I)nCGACCT。
[0029]SEQ ID NO.17：TGGAGCATGTGGTTTAATT(I)nCGAGCT。
[0030]SEQ ID NO.18：GATGAAGCGTTGAATTGA(I)nAGCCCG。
[0031]SEQ ID NO.19：ATTAGCCCCATTGACTAAAAGGTT(I)nAGGCAG。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合，其特征在于，所述引物组合包括ARMs
‑
桥联引物和媒介引物；所述ARMs
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桥联引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示序列；所述媒介引物的核酸序列包括SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.37所示序列；所述探针的核酸序列包括SEQ ID NO.38～SEQ ID NO.54所示序列。2.根据权利要求1所述的用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5
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端标记有荧光发生基团，3
’
端标记荧光淬灭基团；优选地，所述荧光发生基团包括ROX、HEX或CY5中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1。3.权利要求1或2所述的用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合在制备检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的产品中的应用。4.一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合。5.根据权利要求4所述的用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：何诗琼，许泽仰，葛毅媛，谢龙旭，
申请(专利权)人：深圳凯鹏医学检验实验室广东凯普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：