一种区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种可区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物及试剂盒。该引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.7所示和如序列表中SEQ ID NO.8所示。所述试剂盒用于区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌时，按照以下步骤进行：从待检样品中提取细菌基因组DNA作为模板，以核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对作为检测引物，结合大肠杆菌捕获探针、多杀性巴氏杆菌捕获探针和沙门氏菌捕获探针进行PCR扩增，检测PCR扩增产物中是否在363bp、664bp、507bp的扩增产物。本发明专利技术检测时间短，特异性好，准确度高。高。

【技术实现步骤摘要】
一种区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物信息检测
，更具体地说，是涉及一种可区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物及试剂盒。

技术介绍

[0002]养鸡过程中，发生病原感染时，腹泻和肝脏病变是发病鸡经常出现的临床症状和病理变化，可同时引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌有大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌等。大肠杆菌在自然条件下可感染不同日龄的鸡，是危害养鸡业的重要致病菌，鸡群感染后可引起多种病症，如腹泻、心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎等。鸡多杀性巴氏杆菌病是由禽多杀性巴氏杆菌引起的鸡的一种急性败血性传染病，病鸡剧烈下痢，剖检可见心冠脂肪出血，肝脏肿大，表面有针尖状灰黄色或灰白色坏死点，死亡率较高，在家禽生产中造成严重的经济损失。鸡沙门氏菌病是鸡的一种常见细菌病，病鸡拉白色稀粪，肛门常被硬结的粪块封闭，引起呼吸困难，主要病变可见肝脏肿大，有大小不等、数量不一的坏死点。大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌是危害鸡的三种常见致病菌，占鸡的细菌性感染的90％以上。三种病原感染鸡引起的临床症状和病变特征十分相似，都会引起鸡的腹泻和肝脏损伤，仅凭病变特点很难区分开来，而三种病原的耐药特点不一，用药也不一样，为了实现快速准确的诊断，及时用药以减少疾病造成的死亡，降低对生长性能的不利影响，需要针对这三种细菌建立快速准确的鉴别诊断方法。现有文献已有报道检测鸡大肠杆菌的PCR方法、检测鸡多杀性巴氏杆菌的PCR方法、检测鸡沙门氏菌的PCR方法以及检测其中两种或三种细菌的双重或三重PCR方法。普通PCR指在同一个反应体系中只需加入一对引物，扩增一段基因，主要用于单个病原的检测。多重PCR是在普通PCR基础上建立起来的，在一个PCR反应体系中加入多对引物，实现对多种病原的同时检测，节约了检测时间和成本，但因加入的引物较多，引物之间的相互结合及引物二聚体的形成几率大大增加，容易造成假阳性或假阴性，使得该方法的特异性降低。
[0003]针对现有技术不足，本专利技术设计仅用一对引物就能区别大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌三种细菌的PCR方法。本方法能在一个PCR反应体系和一次PCR反应中同时检测三种细菌，减轻工作量并节省时间，达到快速检测的目的，与检测这三种细菌的双重、三重PCR方法相比，特异性更好，准确度更高。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物及试剂盒。
[0005]本专利技术的目的是通过如下技术方案来实现的：一种区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物，所述引物序列如下：T
‑
F：5
’‑
TCCAACCCATCGCCGATGCC
‑3’
，
T
‑
R：5
’‑
CGTATTTTGAGTTGGATGCT
‑3’
；其中，所述引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌为大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌。
[0006]上述一种引物在制备区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的试剂盒中的应用，所述引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌为大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌。
[0007]一种区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的试剂盒，其包括上述的引物。
[0008]进一步的，上述试剂盒还包括大肠杆菌捕获探针、多杀性巴氏杆菌捕获探针和沙门氏菌捕获探针；所述大肠杆菌捕获探针是以猪线粒体基因组DNA为模板，利用大肠杆菌捕获探针引物gapA
‑
F和gapA
‑
R通过PCR扩增获得，片段大小162bp；所述多杀性巴氏杆菌捕获探针是以猪线粒体基因组DNA为模板，利用多杀性巴氏杆菌捕获探针引物KMT1
‑
F和KMT1
‑
R通过PCR扩增获得，片段大小463bp；所述沙门氏菌捕获探针是以猪线粒体基因组DNA为模板，利用沙门氏菌捕获探针引物InvA
‑
F和InvA
‑
R通过PCR扩增获得，片段大小306bp；其中，所述大肠杆菌捕获探针引物gapA
‑
F和gapA
‑
R序列如下：gapA
‑
F：5
’‑
ATGGATGTCGAAATCGTCGTCCCCTACGACCAGGCACATC
‑3’
，gapA
‑
R：5
’‑
CGACGGCAATTTCGACGACGGGCTGCATATTCTACGTTAA
‑3’
；所述多杀性巴氏杆菌捕获探针引物KMT1
‑
F和KMT1
‑
R序列如下：KMT1
‑
F：5
’‑
GACACTGGCGAACTAAGTAGCCCCTACGACCAGGCACATC
‑3’
，KMT1
‑
R：5
’‑
TCATCGCTCAAGCAAATGCCGGCTGCATATTCTACGTTAA
‑3’
；所述沙门氏菌捕获探针引物InvA
‑
F和InvA
‑
R序列如下：InvA
‑
F：5
’‑
TTACGTATAAGCATTGCGAGCCCCTACGACCAGGCACATC
‑3’
，InvA
‑
R：5
’‑
AAACGGTCTCTCCGCCCCGAGGCTGCATATTCTACGTTAA
‑3’
。
[0009]进一步的，上述试剂盒用于区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌时，按照以下步骤进行：从待测样品中提取细菌基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，检测是否在363bp、664bp、507bp的扩增产物；其中，所述PCR扩增的反应体系为：Taq酶1μL，DNA连接酶1μL，10
×
DNA连接酶buffer5μL，10
×
Taq酶buffer 5μL，10mM dNTP 5μL，10μM引物T
‑
F 1μL，10μM引物T
‑
R 1μL，1pg/μL大肠杆菌捕获探针2μL，1pg/μL多杀性巴氏杆菌捕获探针2μL，1pg/μL沙门氏菌捕获探针2μL，模板6μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL；所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性45s，53℃退火10min，10个循环；然后95℃变性35s，53℃退火35s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0010]进一步的，上述检测为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0011]进一步的，上述检测的判断方法如下：如果存在363bp的扩增产物，则说明待检样品中含有大肠杆菌；如果存在664bp的扩增产物，则说明待检样品中含有多杀性巴氏杆菌；如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物，其特征在于：所述引物序列如下：T
‑
F：5
’‑
TCCAACCCATCGCCGATGCC
‑3’
，T
‑
R：5
’‑
CGTATTTTGAGTTGGATGCT
‑3’
。2.根据权利要求1所述的区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的引物，其特征在于：所述引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌为大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌。3.如权利要求1所述的引物在制备可区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的试剂盒中的应用。4.一种区别引起鸡腹泻和肝脏损伤的常见致病菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括大肠杆菌捕获探针、多杀性巴氏杆菌捕获探针和沙门氏菌捕获探针；所述大肠杆菌捕获探针是以猪线粒体基因组DNA为模板，利用大肠杆菌捕获探针引物gapA
‑
F和gapA
‑
R通过PCR扩增获得，片段大小162bp；所述多杀性巴氏杆菌捕获探针是以猪线粒体基因组DNA为模板，利用多杀性巴氏杆菌捕获探针引物KMT1
‑
F和KMT1
‑
R通过PCR扩增获得，片段大小463bp；所述沙门氏菌捕获探针是以猪线粒体基因组DNA为模板，利用沙门氏菌捕获探针引物InvA
‑
F和InvA
‑
R通过PCR扩增获得，片段大小306bp；所述大肠杆菌捕获探针引物gapA
‑
F和gapA
‑
R序列如下：gapA
‑
F：5
’‑
ATGGATGTCGAAATCGTCGTCCCCTACGACCAGGCACATC
‑3’
，gapA
‑
R：5
’‑
CGACGGCAATTTCGACGACGGGCTGCATATTCTACGTTAA
‑3’
；所述多杀性巴氏杆菌捕获探针引物KMT1
‑
F和KMT1
‑
R序列如下：KMT1
‑
F：5
’‑
GAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟敏，钟云平，钟颖良，刘峥，
申请(专利权)人：赣州市畜牧水产研究所，
类型：发明
国别省市：