一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组及其应用。该用于检测诺卡菌属细菌的引物组包括：如SEQ ID NO:1所示的上游引物F、如SEQ ID NO:2所示的下游引物R、如SEQ ID NO:3所示的探针P。采用该引物组能够快速高效、高灵敏性和高特异性地检出诺卡菌属的12种诺卡菌，大大提高诺卡菌属细菌的检测范围，并且与传统的分离培养技术相比，提高了检测效率。提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组及其应用。

技术介绍

[0002]诺卡菌(Nocardia)是一类广泛存于空气、土壤、海水的放线菌。诺卡菌病是一种急性或慢性化脓性或肉芽肿性的病变，其中免疫力低下的人群最易感染，诺卡菌感染部位主要发生在人的肺部，皮肤软组织以及脑部等。由于肺诺卡菌病患者的临床表现没有特异性，因此较易误诊为结核、真菌感染以及细菌性脓肿等其他感染性疾病，从而错过了最佳的治疗时间，提高了死亡率。随着临床免疫抑制剂的广泛使用以及器官移植、艾滋病以及系统性红斑狼疮等免疫缺陷病人逐渐增多，因此亟需发展一种简单快速的检测技术用于辅助诺卡菌的临床诊断。
[0003]根据国内外的报道，发现对人致病的诺卡菌主要有：星型诺卡菌(N.asteroides)、豚鼠诺卡菌(N.otitidiscaviarum)、巴西诺卡菌(N.brasiliensis)、鼻疽诺卡菌(N.farcinica)等等。然而传统的鉴定方法如分离培养、表型鉴定等，周期一般都需5
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7天，且操作过程均较为繁琐，容易延误病情，难以满足目前的临床诊断需求。随着分子生物学鉴定技术的发展，目前已有一些用于鉴定诺卡菌的PCR方法，例如利用嵌套PCR和多重PCR等技术，但其依赖于凝胶电泳解读结果，且存在交叉污染的可能。然而实时荧光定量PCR检测方法具有快速高效、高通量，以及高敏感性和特异性的优点，在辅助诺卡菌的临床诊断上具有重要的意义。
专利
技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组，采用该引物组能够快速高效、高灵敏性和高特异性地检出诺卡菌属的12种诺卡菌，大大提高诺卡菌属细菌的检测范围，并且与传统的分离培养技术相比，提高了检测效率。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组，包括：
[0006]上游引物F：AGCGAACAGGATTAGATACC(SEQ ID NO:1)；
[0007]下游引物R：TACACCGACCACAAGGGG(SEQ ID NO:2)；
[0008]探针P：TTCCTTCCACGGGATC(SEQ ID NO:3)。
[0009]考虑到以一对引物扩增检测多种类的诺卡菌，同时考虑到16S rRNA基因与分枝杆菌属内的一些病原菌的16S rRNA基因十分相似，且需要保证不出现假阳性或者假阴性，本专利技术人通过大量实验摸索，最终得到上述引物组。该引物组中的上游引物、下游引物、探针针对12种诺卡菌的16S rRNA基因的保守区域设计得到，采用上述上游引物、下游引物能够快速高效、高灵敏性地检出诺卡菌属细菌，且覆盖12种诺卡菌的检出，大大提高诺卡菌属细菌的检测范围；采用上述探针与上下游引物配合，能够高特异性地检出诺卡菌属细菌，将诺卡菌属细菌与分枝杆菌属细菌区分开来，避免出现假阳的结果；采用上述引物组来检测诺
卡菌属细菌，能够在短时间内完成检测，与传统需要3天以上的分离培养技术相比，提高了检测效率。
[0010]在其中一个实施例中，所述探针P采用FAM为荧光基团，采用MGB为荧光淬灭基团。
[0011]在其中一个实施例中，所述诺卡菌属细菌包括：巴西诺卡菌、鼻疽诺卡菌、凹陷诺卡菌、豚鼠耳炎诺卡菌、关节炎诺卡菌、假巴西诺卡菌、优美诺卡菌、盖尔森基兴诺卡菌、脓肿诺卡菌、萜烯诺卡菌、天美诺卡菌，和华莱士诺卡菌中的至少1种。
[0012]采用本专利技术的引物组能够覆盖12种诺卡菌的检出，包括巴西诺卡菌(N.brasiliensis)、鼻疽诺卡菌(N.farcinica)、凹陷诺卡菌(N.concava)、豚鼠耳炎诺卡菌N.otitidiscaviarum)、关节炎诺卡菌(N.arthritidis)、假巴西诺卡菌(N.pseudobrasiliensis)、优美诺卡菌(N.elegans)、盖尔森基兴诺卡菌(N.cyriacigeorgica)、脓肿诺卡菌(N.abscessus)、萜烯诺卡菌(N.terpenica)、天美诺卡菌(N.amamiensis)、华莱士诺卡菌(N.wallacei)。大大提高了诺卡菌属细菌的检测范围，同时较传统的分离培养技术提高了检测效率，大大提高诺卡菌属细菌的检测范围。
[0013]本专利技术还提供了所述引物组在制备用于诺卡菌属细菌检测试剂中的应用。
[0014]本专利技术还提供了一种用于检测诺卡菌属细菌的试剂盒，包括所述引物组。
[0015]在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括：预混液，ddH2O，和参考染料。
[0016]本专利技术还提供了一种非诊断目的的诺卡菌属细菌的检测方法，包括以下步骤：提取待测样本的核酸，采用所述试剂盒进行PCR反应。
[0017]在其中一个实施例中，所述PCR反应的条件为：37℃污染消化2min；95℃预变性5min；95℃变性15sec；55℃延伸45sec，40个循环。
[0018]在延伸/退火环节采用上述温度，与常规的60℃相比，能够提高某些诺卡菌中的CT值，对于载量低的待测样本，能够减少假阴性结果。
[0019]在其中一个实施例中，所述PCR反应于55℃45sec处收集荧光信号。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本专利技术的一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组及其应用，该引物组能够快速高效、高灵敏性和高特异性地检出诺卡菌属细菌，大大提高诺卡菌属细菌的检测范围，并且与传统的分离培养技术相比，提高了检测效率。该引物组针对12种诺卡菌只需设计一对特异性上下游引物和一条特异性探针，大大节约了成本，且检测时间较短，能在80分钟左右完成检测，加快了临床的诊断效率。
附图说明
[0022]图1为实施例中探针确定过程汇总的DNAMAN序列比对结果图，图中间高亮区即为本专利技术的探针序列。
具体实施方式
[0023]为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0024]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0025]定义：
[0026]参考染料：指用于在实时定量PCR或RT
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PCR中对荧光报告基因信号进行标准化的溶液。
[0027]本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
[0028]实施例
[0029]一种用于检测诺卡菌属细菌的试剂盒及其检测方法。
[0030]一、材料与方法。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测诺卡菌属细菌的引物组，其特征在于，包括：上游引物F：AGCGAACAGGATTAGATACC(SEQ ID NO:1)；下游引物R：TACACCGACCACAAGGGG(SEQ ID NO:2)；探针P：TTCCTTCCACGGGATC(SEQ ID NO:3)。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针P采用FAM为荧光基团，采用MGB为荧光淬灭基团。3.根据权利要求1
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2所述的引物组，其特征在于，所述诺卡菌属细菌包括：巴西诺卡菌、鼻疽诺卡菌、凹陷诺卡菌、豚鼠耳炎诺卡菌、关节炎诺卡菌、假巴西诺卡菌、优美诺卡菌、盖尔森基兴诺卡菌、脓肿诺卡菌、萜烯诺卡菌、天美诺卡菌，和华莱士诺卡菌中的至少1种。4.权利要求1
‑
3中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：余艳，罗萍，朱加琳，唐春燕，谭兵健，代冰，苏洁琼，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：