一种检测蜡样芽孢杆菌族细菌的基因、引物对、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测蜡样芽孢杆菌族细菌的基因、引物对、检测试剂盒和检测方法，属于生物检测技术领域。本发明专利技术提供了一种鉴别蜡样芽孢杆菌族细菌的试剂，根据5类蜡样芽孢杆菌族细菌的特异基因作为鉴别标志物，如根据yhEN、Cry1AC、vrrA、adhA、reSE的一种或多种设计引物。本发明专利技术基于LAMP的方法对蜡样芽孢杆菌族细菌进行检测并鉴定，操作简单易行。本发明专利技术能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到芽孢杆菌，不需要复杂仪器，能较好满足对芽孢杆菌的现场检测。本发明专利技术为食品中蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌检测提供了新的技术平台。蕈状芽孢杆菌检测提供了新的技术平台。蕈状芽孢杆菌检测提供了新的技术平台。

【技术实现步骤摘要】
一种检测蜡样芽孢杆菌族细菌的基因、引物对、检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测蜡样芽孢杆菌族细菌的基因、引物对、检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]蜡样芽孢杆菌族细菌属于芽孢杆菌属，是一种能产生耐酸、耐热和耐干燥孢子的革兰氏阳性杆菌，是一种常见的食源性污染菌和条件致病菌，与大量的食物中毒事件相关。主要包括蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌。它在酵母、奶粉、牛奶和面粉等食品中大量存在，其自身可以产生腹泻毒素和呕吐毒素，误食该病原菌会引起全身感染和食物中毒，如腹泻、呕吐、脑膜炎等，严重影响人们的身体健康。目前对该种细菌的检测还没有有效的检测防治措施，所以建立蜡样芽孢杆菌族细菌的快速检测对于保障食品安全具有重要的意义。
[0003]目前，针对蜡样芽孢杆菌族细菌的主要方法是采用传统的选择性培养基培养并依据形态学特征对其进行鉴定。这些方法具有检测结果可靠、重复性高、可操作性强等优点。但是，该方法检测时间长、靶向性差、培养过程中容易受到杂菌污染，易检出假阳性。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到蜡样芽孢杆菌族细菌的检测中。普通PCR方法虽然已成功用于检测，但其过程复杂时间较长，无法满足快速检测的需求。
[0004]自2000年环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediatedisothermalamplification,LAMP)首次被报道后，已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究。由于该技术特异性强、等温高效、操作简便、耗时短且产物易被检测等特点，因而有着极为广泛的应用前景。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物(两条外引物，两条内引物)，利用链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生。虽然该技术已发展近20年，但在食源性中五种芽孢杆菌的检测报道较少。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测蜡样芽孢杆菌族细菌的基因、引物对、检测试剂盒和检测方法，检测时间短、灵敏度高、准确性强，并可以肉眼观察检测结果。
[0006]本专利技术提供了一种鉴别蜡样芽孢杆菌族细菌的试剂，所述试剂包括扩增以下至少一个基因的试剂：yhEN、Cry1AC、vrrA、adhA和reSE。
[0007]优选的，所述蜡样芽孢杆菌族细菌包括蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌。
[0008]本专利技术提供了一种鉴别蜡样芽孢杆菌族细菌的引物组，包括针对以下至少一个基因设计的LAMP引物组：yhEN、Cry1AC、vrrA、adhA和reSE。
[0009]优选的，针对yhEN设计的LAMP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的F3
‑
yhEN、SEQ ID No.2所示的B3
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yhEN、SEQ ID No.3所示的FIP
‑
yhEN、SEQ ID No.4所示的BIP
‑
yhEN和SEQ ID No.5所示的LF
‑
yhEN；
[0010]针对Cry1Ac基因设计的LAMP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的F3
‑
Cry1Ac、SEQ ID No.7所示的B3
‑
Cry1Ac、SEQ ID No.8所示的FIP
‑
Cry1Ac、SEQ ID No.9所示的BIP
‑
Cry1Ac和SEQ ID No.10所示的LB
‑
Cry1Ac；
[0011]针对vrrA基因设计的LAMP引物组包括：SEQ ID No.11所示的F3
‑
vrrA、SEQ ID No.12所示的B3
‑
vrrA、SEQ ID No.13所示的FIP
‑
vrrA、SEQ ID No.14所示的BIP
‑
vrrA和SEQ ID No.15所示的LF
‑
vrrA；
[0012]针对adhA基因设计的LAMP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的F3
‑
adhA、SEQ ID No.17所示的B3
‑
adhA、SEQ ID No.18所示的FIP
‑
adhA、SEQ ID No.19所示的BIP
‑
adhA、SEQ ID No.20所示的LF
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adhA和SEQ ID No.21所示的LB
‑
adhA；
[0013]针对reSE基因设计的LAMP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的F3
‑
reSE、SEQ ID No.23所示的B3
‑
reSE、SEQ ID No.24所示的FIP
‑
reSE、SEQ ID No.25所示的BIP
‑
reSE、SEQ ID No.26所示的LF
‑
reSE和SEQ ID No.27所示的LB
‑
reSE。
[0014]本专利技术提供了一种鉴别蜡样芽孢杆菌族细菌的方法，包括以下步骤：以样本来源的基因组DNA为模板，分别利用上述引物组进行LAMP反应，根据颜色变化确定蜡样芽孢杆菌族细菌的有无和种类；
[0015]当发生颜色变化或荧光变化时，yhEN基因阳性表明含有蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；Cry1AC基因阳性表明含有苏云金芽孢杆菌；vrrA基因阳性表明含有蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌；adhA基因阳性表明含有巨大芽孢杆菌；reSE基因阳性表明含有蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。
[0016]优选的，每个所述LAMP反应的体系中包括：0.2～0.4μM正向外引物F3，0.2～0.4μM反向外引物B3，0.8～1.6μM正向内引物FIP，0.8～1.6μM反向内引物BIP，0.4～0.8μM环引物LF，0.4～0.8μM环引物LB；
[0017]或包括：0.2～0.4μM正向外引物F3，0.2～0.4μM反向外引物B3，0.8～1.6μM正向内引物FIP，0.8～1.6μM反向内引物BIP，0.4～0.8μM环引物LB；
[0018]或包括：0.2～0.4μM正向外引物F3，0.2～0.4μM反向外引物B3，0.8～1.6μM正向内引物FIP，0.8～1.6μM反向内引物BIP，0.4～0.8μM环引物LF。
[0019]优选的，每个所述LAMP反应的体系以10μL计，还包括10
×
LAMPBuffer，1.4mMdNTPs，4M甜菜碱，2mMMg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别蜡样芽孢杆菌族细菌的试剂，其特征在于，所述试剂包括扩增以下至少一个基因的试剂：yhEN、Cry1AC、vrrA、adhA和reSE。2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌族细菌包括蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌。3.一种鉴别蜡样芽孢杆菌族细菌的引物组，其特征在于，包括针对以下至少一个基因设计的LAMP引物组：yhEN、Cry1AC、vrrA、adhA和reSE。4.根据权利要求3所述引物组，其特征在于，针对yhEN设计的LAMP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的F3
‑
yhEN、SEQ ID No.2所示的B3
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yhEN、SEQ ID No.3所示的FIP
‑
yhEN、SEQ ID No.4所示的BIP
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yhEN和SEQ ID No.5所示的LF
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yhEN；针对Cry1Ac基因设计的LAMP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的F3
‑
Cry1Ac、SEQ ID No.7所示的B3
‑
Cry1Ac、SEQ ID No.8所示的FIP
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Cry1Ac、SEQ ID No.9所示的BIP
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Cry1Ac和SEQ ID No.10所示的LB
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Cry1Ac；针对vrrA基因设计的LAMP引物组包括：SEQ ID No.11所示的F3
‑
vrrA、SEQ ID No.12所示的B3
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vrrA、SEQ ID No.13所示的FIP
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vrrA、SEQ ID No.14所示的BIP
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vrrA和SEQ ID No.15所示的LF
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vrrA；针对adhA基因设计的LAMP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的F3
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adhA、SEQ ID No.17所示的B3
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adhA、SEQ ID No.18所示的FIP
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adhA、SEQ ID No.19所示的BIP
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adhA、SEQ ID No.20所示的LF
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adhA和SEQ ID No.21所示的LB
‑
adhA；针对reS...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔浪军，陈蓓，刘巧莉，景鹏飞，冯润东，王丽芳，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：