【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，涉及一种检测hpv病毒基因分型的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)属于乳头多瘤空泡病毒科(papovaviridae)乳头瘤病毒属，是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。目前已经确定hpv型别已经超过了120种，约30余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，从而导致尖锐湿疣以及宫颈病变，甚至可能引起宫颈癌的发生。
2、不同亚型的hpv感染导致不同病变，根据病变的程度高低，将hpv亚型分为高危型、潜在高危型和低危型。研究表明：hpv16、18、31、33、35、39、45、51、
3、52、56、58、59、68等为高危型别，hpv26、53、66、73、82等为潜在高危型别，hpv6、11等为低危型别，其中hpv16型和宫颈癌发生的相关性最大，hpv18次之。目前已知增加hpv持续感染机会的协同因素包括吸烟、免疫系统受损、hiv病毒感染等。由hpv感染引起的相关性宫颈肿瘤的进展比较缓慢，重度不典型增生进展为宫颈浸润癌，平均需要3-7年，因此hpv感染的患者适于进行频率较低的检查。此外，hpv在体外不能增殖，故不能用培养法检测。传统方法主要是通过形态学与免疫学方法对其进行检测，但特异性和灵敏度不够理想，且不能对hpv进行分型，因而分子生物学的方法是目前hpv分型检测的主要技术。
4、本专利技术采用熔解曲线法进行对不同hpv型别的分型检测，目前主流的多重不对称pcr扩增结合熔解曲线分析技
5、2.熔解曲线分析的区分度不好：各个靶标之间的熔解峰的熔点范围间隔较近，容易邻近熔解峰互相干扰，出现融合峰等情况；
6、3.荧光探针成本高昂：目前主流的技术方案是一个靶标对应一条探针，如需检测20种左右的hpv分型，就需要20条左右的探针，合成成本高昂，且探针数目过多影响反应结果的特异性。
7、为解决上述问题，本专利技术使用改进的多重不对称pcr扩增结合熔解曲线法进行hpv基因分型检测，具体表现为不对称pcr扩增时使用封闭引物，熔解曲线分析时使用超级淬灭的pco(partially complementary oligonucleotide，部分互补序列)探针。本专利技术还引入内源性的内参照系统，用于监测样本取样质量以避免检测结果的假阴性。和现有人乳头瘤病毒核酸分型检测公开技术比较，本专利技术可在单管内快速分型、定性检测20种高危、潜在高危和低危hpv基因分型，灵敏度高，特异性强，具有明确的临床意义和应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于20种人乳头瘤病毒基因分型检测方法，已解决现有检测技术中存在的检测时间偏长、分型数量不足、分型不清晰等缺点。
2、本专利技术还提供一种用于20种人乳头瘤病毒基因分型检测的引物探针组合物和试剂盒。
3、基于上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、第一方面，本专利技术提供一种用于20种hpv病毒基因分型检测的引物探针组合物，该组合物包括引物组和探针组。
5、所述引物组包括：
6、引物1：如seq id no1.所示，
7、引物2：如seq id no.2所示，
8、引物3：如seq id no.3所示，
9、引物4：如seq id no.4所示，
10、引物5：如seq id no.5所示，
11、引物6：如seq id no.6所示，
12、引物7：如seq id no.7所示，
13、引物8：如seq id no.8所示，
14、引物9：如seq id no.9所示，
15、引物10：如seq id no.10所示，
16、引物11：如seq id no.11所示，
17、引物12：如seq id no.12所示，
18、引物13：如seq id no.13所示，
19、引物14：如seq id no.14所示，
20、引物15：如seq id no.16所示，引物16：如seq id no.16所示，引物17：如seq idno.17所示，引物18：如seq id no.18所示，引物19：如seq id no.19所示，引物20：如seq idno.20所示，引物21：如seq id no.21所示，引物22：如seq id no.22所示，引物23：如seq idno.23所示，引物24：如seq id no.24所示，引物25：如seq id no.25所示，引物26：如seq idno.26所示，引物27：如seq id no.27所示，引物28：如seq id no.28所示，引物29：如seq idno.29所示，引物30：如seq id no.30所示，引物31：如seq id no.31所示，引物32：如seq idno.32所示，引物33：如seq id no.33所示，引物34：如seq id no.34所示引物35：如seq idno.35所示，引物36：如seq id no.36所示，引物37：如seq id no.37所示，引物38：如seq idno.38所示，引物39：如seq id no.39所示，引物40：如seq id no.40所示，引物41：如seq idno.41所示，引物42：如seq id no.42所示，引物43：如seq id no.43所示，引物44：如seq idno.44所示，所述探针组包括：
21、探针a：如seq id no.45所示，探针b：如seq id no.46所示，探针c：如seq idno.47所示，
22、探针d：如seq id no.48所示，
23、探针e：如seq id no.49所示。
24、作为优选方案，上述引物探针组合物是用于对以下20种hpv病毒基因的分型：hpv6、hpv11、hpv16、hpv 18、hpv26、hpv 31、hpv 33、hpv 35、hpv 39、hpv 45、hpv 51、hpv52、hpv 53、hpv 56、hpv 58、hpv59、hpv 66、hpv 68、hpv73和hpv82。
25、作为优选方案，hpv33、hpv35、hpv52、hpv58、hpv66对应的上游引物分别为如seqid no.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测HPV病毒基因分型的引物探针组合物，其特征在于，包括引物组SEQ IDNO1-44，和探针组SEQ ID NO45-49。
2.根据权利要求1所述检测HPV病毒基因分型的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物是用于对以下20种HPV病毒基因的分型：HPV6、HPV11、HPV16、HPV 18、HPV26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 56、HPV 58、HPV59、HPV 66、HPV 68、HPV73和HPV82。
3.根据权利要求2所述检测HPV病毒基因分型的引物探针组合物，其特征在于，HPV33、HPV35、HPV52、HPV58、HPV66对应的上游引物分别为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示的
4.根据权利要求3所述检测HPV病毒基因分型的引物探针组合物，所述引物组为不对称PCR扩增的封闭引物，所述SEQ ID NO奇数序号为限制性引物，所述SEQ ID NO偶数序号为非限制性引物，所述探针组包括探针A,B,C,D,E，其特征在于：所述限制性引物的浓度为0.02～0.05μM；所述非限制性引物的浓度为0.2～1μM；所述探针组的浓度为0.2～0.4μM。
5.根据权利要求3所述检测HPV病毒基因分型的引物探针组合物，其特征在于，所述探针A,B,C,D为长度30-60nt的超级淬灭探针，所述超级淬灭探针为TaqMan探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，5’端与3’端序列之间设有至少一个淬灭基团。
6.一种用于HPV病毒基因分型检测的检测盒，其特征在于，包括权利要求1-5任一所述引物探针组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：特异性扩增人基因组β-Globin基因的引物和特异性针对β-Globin的探针E。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性扩增人基因组β-Globin基因的引物是SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44引物；所述探针E如SEQ ID NO:49所示，为长度30-35nt、Tm值介于74℃～75℃、5’端连接有VIC荧光基团的Taqman探针。
9.一种检测HPV病毒基因分型的检测方法，所述检测方法用于非疾病诊断目的，其特征在于，所述检测方法包括：利用权利要求6-8任一所述试剂盒对样品进行多重不对称PCR检测，判断HPV型别。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种检测hpv病毒基因分型的引物探针组合物，其特征在于，包括引物组seq idno1-44，和探针组seq id no45-49。
2.根据权利要求1所述检测hpv病毒基因分型的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物是用于对以下20种hpv病毒基因的分型：hpv6、hpv11、hpv16、hpv 18、hpv26、hpv 31、hpv 33、hpv 35、hpv 39、hpv 45、hpv 51、hpv 52、hpv 53、hpv 56、hpv 58、hpv59、hpv 66、hpv 68、hpv73和hpv82。
3.根据权利要求2所述检测hpv病毒基因分型的引物探针组合物，其特征在于，hpv33、hpv35、hpv52、hpv58、hpv66对应的上游引物分别为如seq id no.1、seq id no.3、seq idno.5、seq id no.7、seq id no.9所示的核苷酸序列，对应的下游引物分别为如seq idno.2、seq id no.4、和seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10所示的核苷酸序列，并共用一条超级淬灭探针进行不对称pcr扩增和熔解曲线分析，所述探针如seq id no.45所示；
4.根据权利要求3所述检测hpv病毒基因分型的引物探针组合物，所述引物组为不对称pcr扩增的封闭引物，所述seq id no奇数序号为限制性引物，所述seq id no偶数序号为非限制...
【专利技术属性】
技术研发人员：佟悦，汪峰，迟翔宇，吴冰，
申请(专利权)人：天津威高分子诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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