一种Inclisiran药物中间体纯度的检测方法技术

本申请属于药物检测技术领域，公开了一种Inclisiran药物中间体正义链和反义链纯度的检测方法。本申请通过采用反相离子对高效液相色谱法，可同时分离正义链和反义链中包括缩短序列杂质(5

【技术实现步骤摘要】
一种Inclisiran药物中间体纯度的检测方法


[0001]本专利技术属于药物检测
，具体涉及一种检测Inclisiran药物中间体中缩短序列杂质、硫代不完全序列杂质、全氧代序列杂质和增长序列杂质的方法。

技术介绍

[0002]人工合成的小干扰RNA(siRNA)药物通过碱基互补配对实现对靶点的限制性选择并直接靶向特定基因，具有较高的特异性，将药物靶点扩大至功能性蛋白质的上游，从转录后水平调控靶基因的表达。相较于抗体药物和小分子药物，siRNA药物具有靶点丰富、合成方便、临床前研发周期短、不良反应可控等优点，已迅速成为分子生物学中分析蛋白质功能和确定新的治疗靶点的重要工具。目前，各种siRNA分子在临床研究中治疗包括癌症、病毒感染和眼部疾病，具有很好的药学应用前景[siRNA药物研究进展[J].中国新药杂志,2022,31(05):427
‑
434.]。
[0003]Inclisiran是一种双链小siRNA分子，可抑制PCSK
‑
9的转录，用于高脂血症和心血管疾病(CVD)研究。Inclisiran作用机理与此前上市的PCSK9抗体不同，PCSK9抗体通过与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，提高肝脏清除LDL
‑
C(低密度脂蛋白胆固醇)的能力，而Inclisiran从源头上关闭PCSK9的生成，从而降低LDL
‑
C水平，并有助于改善动脉粥样硬化患者的预后心血管疾病[新型siRNA药物：Inclisiran在降脂治疗中的研究进展[J].中国医药导刊,2023,25(02):140
‑
145.]。
[0004]Inclisiran的合成工艺杂质包括：
①
正义链：杂质1(缩短序列杂质5
’
n
‑
2)、杂质2(缩短序列杂质5
’
n
‑
1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5
’
n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5
’
n+Af)，
②
反义链：杂质7(缩短序列杂质5
’
n
‑
2)、杂质8(缩短序列杂质5
’
n
‑
1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5
’
n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5
’
n+Af)，由于上述杂质与主成分结构极为相似，因此，很难实现多种杂质的分离。特别是，单氧代杂质和硫代不完全杂质等与主成分相近结构的杂质分离更加困难。例如，硫代不完全杂质和主成分结构仅差一个硫代磷酸二酯键，导致分离愈发困难。目前并未检索到Inclisiran中杂质的分析方法相关专利文件，因此，就以下关于硫代寡核苷酸的杂质分析的国内外文献及专利分析发现：
[0005]文献1：“贾巧云,邓新秀,高婵,鲁丹丹,游松,王升启.反相离子对高效液相色谱法分析硫代反义寡核苷酸CT102相关杂质,药物分析杂志,2013,33(07):1157
‑
1162+1167.”建立硫代反义寡核苷酸CT102及其相关杂质的反相离子对高效液相色谱(IP
‑
RP
‑
HPLC)分析方法。但是其中，仅检测了其中可能存在的缩短序列杂质(3
’
n
‑
1、5
’
n
‑
1)、不完全硫代序列杂质(5
’
(P＝S/O))与CT102的分离情况；但是无法实现其与全氧代序列杂质和增长序列杂质的分离和检测。
[0006]文献2：离子对反相液相色谱法分析硫代寡核苷酸药物流感泰得的有关物质[J].分析化学,2011,39(12):1811
‑
1816建立了离子对反相液相色谱(IP
‑
RPLC)分析流感泰得(Flutide)有关物质的方法，Flutide与缩短序列杂质(5
’
n
‑
1和3
’
n
‑
1)可实现基线分离，但
是，其单氧代序列5
’
(P＝O)1之间的分离度仅为0.94；并且其中也没有记载全氧代序列杂质以及增长序列杂质的分离和检测。
[0007]文献3：Assay,Purity,and Impurity Profile of Phosphorothioate Oligonucleotide Therapeutics by Ion Pair
–
HPLC
–
MS[J].Nucleic acid therapeutics,2022,32(3):206
‑
220建立了液质连用的方法分析不同硫代寡核苷酸药物有关物质，不完全硫代序列杂质(P＝O)1未分离，只能通过EIC提取离子流进行监控。
[0008]因此，本领域存在开发出一种重现性好、能够同时、稳定监控Inclisiran药物中间体正义链：杂质1(缩短序列杂质5
’
n
‑
2)、杂质2(缩短序列杂质5
’
n
‑
1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5
’
n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5
’
n+Af)，反义链：杂质7(缩短序列杂质5
’
n
‑
2)、杂质8(缩短序列杂质5
’
n
‑
1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5
’
n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5
’
n+Af)方法的需求。

技术实现思路

[0009]针对现有技术中存在的缺陷和不足，本申请提供了一种Inclisiran药物中间体正义链和/或反义链的缩短序列杂质、硫代不完全序列杂质、全氧代序列杂质和增长序列杂质的检测方法。
[0010]所述方法可同时分离并检测Inclisiran中间体中的正义链：杂质1(缩短序列杂质5
’
n
‑
2)、杂质2(缩短序列杂质5
’
n
‑
1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5
’
n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5
’
n+Af)，反义链：杂质7(缩短序列杂质5
’
n
‑
2)、杂质8(缩短序列杂质5
’
n
‑
1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5
’
n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Inclisiran药物中间体纯度的检测方法，其包括以下步骤：1)溶液配制：用稀释剂配制Inclisiran药物中间体的供试品溶液；所述供试品溶液包括Inclisiran药物中间体的正义链和对应杂质，和/或反义链和对应杂质；2)采用液相色谱仪对供试品溶液进行检测，液相色谱条件如下：色谱柱：固定相采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A：1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
甲基
‑2‑
丙醇和二丁胺的水溶液，其中1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
甲基
‑2‑
丙醇的浓度为100～400mmol/L；二丁胺的浓度为5～25mmol/L；流动相B：1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
甲基
‑2‑
丙醇和二丁胺的甲醇水溶液，其中1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
甲基
‑2‑
丙醇的浓度为100～400mmol/L；二丁胺的浓度为5～25mmol/L。2.根据权利要求1所述的检测方法，所述液相色谱条件中，洗脱梯度为：3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相A中：1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
甲基
‑2‑
丙醇的浓度为200mmol/L。4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相A中：二丁胺的浓度为20mmol/L。5.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，所述流动相B中：1,1,1,3,3,3
‑
六氟
‑2‑
甲基
‑2‑
丙醇的浓度为200mmol/L。6.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，所述流动相B中：二丁胺的浓度为20mmol/L。7.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述流动相B中，甲醇和水的体积比为甲醇：水＝4:1。8.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述杂质选自以下中的任意一种或多种：Inclisiran药物中间体的正义链和/或反义链的缩短序列杂质、硫代不完全序列杂质、全氧代序列杂质、增长序列杂质。9.根据前述任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述缩短序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上缺失1个或多个碱基；所述硫代不完全序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上其中一个目标碱基没有
被硫代修饰；优选地，在正义链的序列上2个目标碱基中其中一个没有被硫代修饰；在反义链的序列上4个目标碱基中至少一个没有被硫代修饰；所述全氧代序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上4个目标碱基均未被硫代修饰；所述增长序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上增加1个或多个碱基。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晋瑜，宋更申，张文新，米盈盈，申彦华，黄泽傲，
申请(专利权)人：北京悦康科创医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：