【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核糖核酸分离纯化，具体涉及一种生产mrna原液的方法及其应用，特别是工业化生产方法及其应用。
技术介绍
1、mrna疫苗是将编码疾病特异性抗原的mrna通过递送系统引入体内，利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原，从而触发免疫应答。除了疫苗，mrna技术作为通用性平台技术，理论上mrna具有合成任意一种蛋白的潜能，有可能一定程度上替代和补充蛋白质疗法。2020年全球首个mrna疫苗的成功上市标志mrna技术进入商业化时代，随着前期的技术积累和疫情形势的迫切需求，mrna技术进入快速发展时期。尽管如此，mrna疗法的大发展还有待进一步的技术突破，比如序列优化、递送系统设计以及生产工艺的优化等方面还存在诸多挑战。
2、mrna疫苗的生产主要包括：dna模板序列的设计与制备、mrna原液的制备及纯化、mrna制剂的制备(例如，采用lnp对mrna进行包裹)等步骤。其中，mrna原液的制备过程直接影响mrna的质量和生产成本，因此优化mrna原液的制备工艺至关重要。
3、mrna原液的制备包括mrna体外转录(in-vitro transcription，ivt)合成过程和加帽过程。
4、1)、mrna体外转录(ivt)合成过程
5、在mrna原液的制备过程中，mrna体外转录(ivt)合成是在体外的无细胞体系中，以质粒dna为模板，利用rna聚合酶转录合成mrna，并后续为其添加5'帽子和3'poly(a)尾巴等修饰，以模拟体内mrna合成的过程。
6、ivt反应
7、2)、加帽过程
8、在mrna原液的制备过程中，不管是常规非自复制mrna还是自复制mrna，帽子结构(即，m7gpppn结构，又称为甲基鸟苷帽子)都十分重要。mrna5'-端帽子结构是mrna翻译起始的必要结构，为核糖体对mrna的识别提供信号，协助核糖体与mrna结合，使翻译从aug开始。与此同时，帽子结构还能提高mrna的稳定性，保护mrna免遭5'→3'核酸外切酶的攻击。因此，对mrna进行加帽的过程也成为了mrna原液制备阶段中的关键步骤。
9、真核生物mrna的5'端普遍存在一些甲基化核苷，以特殊的方式连接，称为“帽子”结构。帽子结构通常有三种类型：
10、帽0，又称cap0，具有m7g(5′)ppp(5′)n结构；
11、帽1，又称cap1，具有m7g(5′)ppp(5′)nm结构，m7g(5′)pppn的相邻核苷酸的核糖的额外甲基化；以及
12、帽2，又称cap2，具有m7g(5′)ppp(5′)n1mp(5′)n2m结构，m7g(5′)ppp(5′)n下游的2个核苷酸的核糖均甲基化。
13、帽子结构的开始为7-甲基鸟苷(m7g)，它以核糖的5′连接三个磷酸基。末端磷酸基连接下一个核苷(n)，n代表4种核苷(a、g、c、u)中的任何一种，n通常是2'-o-甲基核苷(nm)。帽子分类就是依据nm的有无或多少而分为三类的(参见汪玉松等主编.现代动物生物化学.中国农业科技出版社,第224-225页，1999.03；杨清玲等主编.分子生物学.中国科学技术大学出版社,第134页，2021.10；cn116113430a第[0578]段)。图1示出了一种cap0和cap1(ramanathanm a.,et al.rna capping:biological functions andapplications.nucleic acids res.2016sep 19；44(16):7511-26.doi:10.1093/nar/gkw551)。
14、加帽方法包括酶法加帽和化学法共转录加帽。
15、第一，酶法加帽为两步法，是在t7聚合酶参与的mrna体外转录(ivt)反应结束后，第一次纯化获得未加帽的mrna，通过牛痘病毒加帽酶生成cap0，再通过2'-o-甲基转移酶和s-腺苷甲硫氨酸转化为cap1，经过第二次纯化获得最终的mrna。该过程使总体工艺步骤较为复杂、步骤流程较多，并且引入更多的杂质，增加了qa和/或qc质检项，另外，加帽效率受模板长度、模板序列、5'utr结构等影响较大，导致不同模板的加帽率存在较大差异。
16、第二，化学法共转录加帽为一步法，就是在t7聚合酶参与的ivt反应体系中直接加入帽子类似物，例如cap1-gag(化学结构为m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)pg)，实现一步法获得含cap1结构的mrna，杂质少，全程只需一次纯化。这种“一锅法”反应减少了制备步骤，进而有效缩短整体处理时间、简化纯化步骤，同时减少了所需酶的数量。并且，加帽效率基本不受模板长度等因素的影响。
17、mrna原液的纯化过程，其工艺包括氯化锂沉淀、亲和层析及醋酸纤维素层析。
18、1)传统的氯化锂沉淀方式无法去除不完整mrna、截短rna、双链rna(dsrna)等产品相关杂质，而且大规模生产中较难解决大型离心机设备问题。
19、2)亲和层析可以将带有poly(a)尾的mrna从ivt相关杂质中分离出来，包括过量的核苷、残留的酶、过量的加帽试剂以及缓冲液成分，但依赖于poly(a)尾长度，poly(a)尾长度小于30nt长度时，会影响目标产物mrna与层析填料之间的结合，导致目标产物流失严重，严重影响目标产物的回收率；无法区分单链rna(ssrna)和dsrna，无法有效去除dsrna杂质，需要引入二次纯化过程(包括：疏水相互作用色谱法(ihc)、反相高效液相色谱法(rp-hplc)或者羟基磷灰石色谱法)去除亲和层析捕获步骤后的剩余杂质(包括dsrna、截短的rna和残留蛋白质)，过程繁琐，且回收率低。
20、3)反相高效液相色谱法(rp-hplc)和羟基磷灰石色谱法由于柱负载能力有限而导致规模放大困难和产能限制。纯化过程中的高温和外力作用影响了mrna的完整性；rp-hplc工艺中用到的大量有机溶剂也存在较大的生产安全隐患。
21、4)纤维素层析法在大规模生产过程中面临放大困难、产能有限等问题，同时mrna的完整性也呈现降低趋势。
22、此外，对于工业化生产和小规模生产(实验室级别)其分离纯化方法差异很大。
23、对于实验室级别纯化方法是基于dnase消化去除dna，然后采用氯化锂沉淀的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产mRNA原液的方法，其包括如下步骤：
2.根据前述所述权利要求的方法，其中，步骤1)中所述共转录加帽反应过程中，采用缓冲溶液体系。
3.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述缓冲溶液包括镁离子溶液。
4.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述镁离子浓度为30～50mM，优选40mM。
5.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，步骤2)中所述纯化选自超滤换液和/或层析；优选地，所述层析为亲和层析或纤维素层析；优选地，所述纯化为超滤换液。
6.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述缓冲溶液包括镁离子溶液；
7.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述步骤2)中酶包括RNase III和/或蛋白酶K；优选为RNase III和蛋白酶K组合。
8.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述缓冲溶液包括镁离子溶液；
9.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述RNase III的用量为0.02～0.10U/mg mRNA，优选0.05U/mg mRNA。
10.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述蛋白酶K的用量为30～80ng/μL，优选50ng/μL。
11.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述步骤2)为：先在mRNA反应混合液中加入酶进行降解反应；然后将mRNA反应混合液进行纯化；得到mRNA原液。
12.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述纯化的方法包括超滤换液法、亲和层析法、纤维素层析法中的任意一种或多种组合；优选为超滤换液法或亲和层析法；更优选为超滤换液法。
13.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述缓冲溶液包括镁离子溶液；
14.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述帽子类似物包括Cap1。
15.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述RNA聚合酶包括T7RNA聚合酶。
16.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述mRNA的大小为500～15000bp。
...【技术特征摘要】
1.一种生产mrna原液的方法，其包括如下步骤：
2.根据前述所述权利要求的方法，其中，步骤1)中所述共转录加帽反应过程中，采用缓冲溶液体系。
3.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述缓冲溶液包括镁离子溶液。
4.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述镁离子浓度为30～50mm，优选40mm。
5.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，步骤2)中所述纯化选自超滤换液和/或层析；优选地，所述层析为亲和层析或纤维素层析；优选地，所述纯化为超滤换液。
6.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述缓冲溶液包括镁离子溶液；
7.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述步骤2)中酶包括rnase iii和/或蛋白酶k；优选为rnase iii和蛋白酶k组合。
8.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述缓冲溶液包括镁离子溶液；
9.根据前述任一项所述权利要求的方法，其中，所述rnase iii的用量为0....
【专利技术属性】
技术研发人员：宋更申，董开，李艳芬，吉鑫，张晋瑜，王晨阳，
申请(专利权)人：北京悦康科创医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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