一种抗衰老血管内皮细胞模型及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗衰老血管内皮细胞模型及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明专利技术抗衰老血管内皮细胞模型的制备方法为，在血管内皮细胞培养过程中加入枸杞多糖，并在培养前或培养过程中对细胞进行射频处理，经过处理的细胞缓解了衰老刺激因素诱导的细胞周期阻滞，提高了处于分裂期的细胞量，有效地激活了细胞内SIRT1蛋白的表达，从而减缓细胞衰老。从而减缓细胞衰老。从而减缓细胞衰老。

【技术实现步骤摘要】
一种抗衰老血管内皮细胞模型及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种抗衰老血管内皮细胞模型及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]建立血管内皮细胞培养模型，是体外研究血管内皮细胞功能的实验手段，目前使用最广泛的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)是研究心血管疾病的常用细胞模型，尤其在高血压、心脑血管疾病及肿瘤浸润、转移等的发病机制研究中。但由于离体细胞的衰老速度加快，其内的分子表达水平、细胞活性等对实验结果的影响不可忽视，因此，如何建立一种抗衰老的血管内皮细胞培养模型是当前面临的问题。
[0003]Sirtuin是一种从细菌到人类高度保守的去乙酰化酶类，SIRT1是sirtuin家族中研究最多的一个成员。SIRT1可以去乙酰化组蛋白，还可以去乙酰化很多重要的转录因子和调节蛋白，从而调控多种生物学过程。SIRT1可与多种蛋白相互作用，最初研究认为SIRT1的主要功能是应激条件下减少细胞凋亡及衰老，增加细胞存活率。SIRT1可负调控肿瘤抑制因子p53——这是一种最早发现的SIRT1非组蛋白底物，SIRT1将p53中382位Lys残基去乙酰化，降低p53与DNA顺式元件结合力，减少由其诱导的细胞凋亡。
[0004]高血糖，尤其是间歇性高血糖(IHG)，是血管内皮衰老的主要原因，相关研究通过HUVEC暴露于IHG(5mM或33mM葡萄糖，每12小时交替一次，持续3天)建立衰老细胞模型，发现IHG抑制SIRT1水平并增强内皮衰老，而上调SIRT1水平后衰老标志物p21下调，细胞衰老得以缓解。另有研究证明激活SIRT1能抑制H2O2诱导的HUVECs ROS的生成、细胞活力的下降及细胞的衰老。进一步研究指出：过表达SIRT1基因表达对ox
‑
LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤起保护作用；上调SIRT1的表达能恢复溶酶体功能，增强Ox
‑
LDL诱导受损的自噬通量，并通过自噬
‑
溶酶体降解途径促进Ox
‑
LDL降解。
[0005]综上，提高细胞中SIRT1的表达水平对抗衰老细胞模型的建立有着重要意义，目前尚无此方面的报道。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种血管内皮细胞模型的制备方法以及一种体外激活血管内皮细胞中SIRT1蛋白表达的方法。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种抗衰老血管内皮细胞模型的制备方法，包括以下步骤：在血管内皮细胞培养过程中加入枸杞多糖(LBP)，并在培养前或培养过程中对细胞进行射频处理。
[0008]进一步地，所述枸杞多糖的浓度不高于2000μg/mL。
[0009]进一步地，所述射频处理的频率为100
‑
200hz。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供一种上述制备方法构建的抗衰老血管内皮细胞模型。
[0011]进一步地，所述抗衰老血管内皮细胞模型中，缓解了衰老刺激因素诱导的细胞周
期阻滞。
[0012]进一步地，提高了处于分裂期的细胞量。
[0013]本专利技术的第三个目的是提供一种上述抗衰老血管内皮细胞模型在制备心血管疾病研究模型中的应用。
[0014]本专利技术的第四个目的是提供上述抗衰老血管内皮细胞模型在制备生物医药中的应用。
[0015]进一步地，所述生物医药包括但不限于心血管疾病(预防或治疗)药物(如动脉粥样硬化)、衰老相关药物、糖尿病药物等。
[0016]本专利技术的第五个目的是提供一种体外激活血管内皮细胞中SIRT1蛋白表达的方法，包括以下步骤：在血管内皮细胞培养过程中加入枸杞多糖，并在培养前或培养过程中对细胞进行射频处理。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]本专利技术通过枸杞多糖干预以及射频处理构建血管内皮细胞模型，发现其能缓解PM
2.5
暴露会导致人体静脉内皮细胞周期发生阻滞、衰老相关表型发生改变、衰老相关基因上调、自噬关键蛋白变化、自噬流障碍等，并且能够有效激活SIRT1的表达以发挥上述作用，减缓细胞衰老。
附图说明
[0019]图1为PM
2.5
暴露后HUVECs的细胞存活率与LDH活性A:CCK8；B:LDH释放量检测(*P＜0.05,**P＜0.01)。
[0020]图2为LBP处理对PM
2.5
暴露后HUVECs的细胞存活率和LDH活性的影响(*P＜0.05,**P＜0.01)。
[0021]图3为LBP减轻PM
2.5
引起的HUVECs自噬损伤。其中，(A)Western blotting检测LBP对PM
2.5
暴露24h后HUVECs中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1、p62蛋白表达的影响。GAPDH用作内部参考。(C
‑
F)RT
‑
qPCR用于检测暴露于PM
2.5 24h后LBP对HUVECs中beclin1和p62 mRNA表达的影响。(G)用mCherry
‑
GFP
‑
LC3腺病毒转染的各种处理的HUVECs的共聚焦荧光显微镜的代表性图像。数据表示为三个独立实验的平均值
±
标准差(*P<0.05，**P<0.01)。
[0022]图4
‑
7为枸杞多糖减轻PM
2.5
引起的人脐静脉内皮细胞衰老。其中，图4为β
‑
半乳糖苷酶染色后，通过光学显微镜观察LBP对PM
2.5
暴露24h后HUVECs衰老的影响。图5为用流式细胞仪检测LBP对PM
2.5
暴露24h后HUVECs细胞周期的影响。图6为在暴露于PM
2.5 24h后，通过Western blotting检测LBP对HUVECs中PAI
‑
1表达的影响。GAPDH用作内部参考。图7为RT
‑
qPCR检测LBP对PM
2.5
染毒24h后HUVECs中IL
‑
1β、IL
‑
6、TNF
‑
α、p16、p21、CDKN2A、CDKN1A和TP53 mRNA表达的影响。数据表示为三个独立实验的平均值
±
标准差(*P<0.05，**P<0.01)。
[0023]图8为LBP激活AMPK/SIRT1/mTOR通路。(A,B,C,D)暴露于PM2.5 24h后，通过Western blotting检测LBP对HUVECs中AMPK、p
‑
AMPK、mTOR、p
‑
mTOR和SIRT1蛋白表达的影响。GAPDH用作内部参考。数据表示为三个独立实验的平均值
±
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗衰老血管内皮细胞模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在血管内皮细胞培养过程中加入枸杞多糖，并在培养前或培养过程中对细胞进行射频处理。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述枸杞多糖的浓度不高于2000μg/mL。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述射频处理的频率为100
‑
200hz。4.权利要求1
‑
3任一项所述的制备方法构建的抗衰老血管内皮细胞模型。5.根据权利要求4所述的抗衰老血管内皮细胞模型，其特征在于：所述抗衰老血管内皮细胞模型中，缓解了衰老刺激因素诱导的细胞周期阻滞。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：武婧，沈昊翀，宫美笛，杨俊杰，吴研，谢小彬，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：