一种单个球虫的分离方法技术

本发明专利技术提供了一种单个球虫的分离方法，属于生物技术领域。一种单个球虫的分离方法将荧光蛋白基因和靶标基因形成的融合基因整合至球虫子孢子基因组中，将整合的子孢子进行药物筛选；采用CellCut激光显微切割操作系统对筛选后的卵囊进行单卵囊分选，培养，得到单个球虫。本发明专利技术提供的方法具有单卵囊分离效率及准确率高的优点，同时由于本发明专利技术基于荧光标记使靶标蛋白可视化的原理，使制备的单球虫符合高内涵筛选平台的基本要求，为筛选靶定基因的抑制剂或者激动剂的高通量筛选奠定了坚实的基础。本模型可应用于球虫药物的筛选，具有的假阳性低、筛选所需样本少、筛选样本量大、易于标准化、筛选速度快、特异性强等优势。特异性强等优势。特异性强等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种单个球虫的分离方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种单个球虫的分离方法。

技术介绍

[0002]球虫是一种研究药物与药物靶标分子的理想材料。将荧光蛋白与药物靶标基因稳定共转染于细胞模型中，药物作用于药靶后，会引起细胞内环境的变化，从而使荧光强度发生改变。通过荧光测定装置来捕捉用药前后的荧光强度变化，可快速地观察到药物与药靶的作用情况。将mCherry或GFP(EGFP)与目的基因融合，可用于细胞分裂、转染状况、染色体复制和分裂、发育和信号转导等。此外，球虫还可用于药物筛选，即根据荧光密度的变化来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态变化。如在药物研发时，将GFP与靶标基因融合共转入球虫中，进行稳定传代后，加入化合物进行处理，通过定量测量GFP标记蛋白的荧光情况，来研究候选小分子化合物在杀灭球虫中的作用。如Wnt
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catenin信号通路抑制剂、微管蛋白聚合解聚筛选、组蛋白去乙酰化酶抑制剂筛选、HMG
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CoA还原酶抑制剂的筛选等。可见，采用靶标基因与荧光蛋白融合，转染球虫，使靶蛋白可视化，为后期球虫药物的筛选奠定了基础。建立高效、灵敏、快速和高通量的筛选模型具有重要意义。
[0003]然而在共转染后，存在转染效果不能达到100％的情况，因此，需要将表达外源荧光蛋白的单个球虫分离出来。传统的单个球虫的分离方法可采用流式细胞技术完成，然而流式细胞分选可能存在精度性差、对分离样本量有一定要求，不能满足于微量样本的精准分离。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种单个球虫的分离方法，具有分离效率高且准确性好的特点。
[0005]本专利技术提供了一种单个球虫的分离方法，包括以下步骤：
[0006]将荧光蛋白基因和靶标基因形成的融合基因整合至球虫子孢子基因组中，将整合后的子孢子进行药物筛选，得到筛选后的卵囊；
[0007]采用CellCut激光显微切割操作系统对所述筛选后的卵囊进行单卵囊分选，培养，得到单个球虫。
[0008]优选的，所述单卵囊分选时，所述筛选后的卵囊置于活细胞培养皿中；
[0009]所述活细胞培养皿分为内皿和外皿；所述内皿嵌套在外皿中并且外皿置于内皿的下方。
[0010]优选的，所述内皿的环壁为金属环，底部由膜密封；
[0011]所述外皿为普通的细胞培养皿。
[0012]优选的，所述单卵囊分选的方法，将所述筛选后的卵囊置于所述内皿中，经荧光观察，用CellCut激光显微切割操作系统进行激光切割表达荧光蛋白的卵囊四周的膜，表达荧光蛋白的单个卵囊落入外皿的培养基中。
[0013]优选的，所述荧光蛋白包括以下至少一种：mCherry、EGFP、EYFP和荧光素酶。
[0014]优选的，所述靶标基因包括球虫的生物酶、离子通道相关蛋白、受体蛋白、蛋白酶体和细胞骨架相关蛋白。
[0015]优选的，所述荧光蛋白和靶标基因融合后整合至球虫子孢子基因组的方法，包括以下步骤：
[0016]1)针对球虫的靶标基因设计gRNA，构建含gRNA的基因编辑质粒；
[0017]2)构建含靶标基因和荧光蛋白基因的同源重组质粒；
[0018]3)将所述含gRNA的基因编辑质粒和含目标基因和荧光蛋白基因的同源重组质粒共同转染球虫的子孢子。
[0019]优选的，所述药物筛选的方法，将整合后的子孢子感染动物，食用筛选药物后，收集粪便，分离卵囊。
[0020]优选的，在单卵囊分选前，对所述药物筛选后的卵囊进行转染效率鉴定；
[0021]所述转染效率鉴定的方法采用Countstar CastorX1高通量智能细胞分析仪完成。
[0022]优选的，所述球虫包括以下至少一种：柔嫩艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、堆型艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫、牛邱氏艾美尔球虫、牛艾美尔球虫、奥博艾美尔球虫、加拿大艾美尔球虫、阿拉巴马艾美尔球虫、柱状艾美尔球虫、斯氏艾美尔球虫、椭圆艾美尔球虫、亚球艾美尔球虫、拨克朗艾美尔球虫、怀俄明艾美尔球虫、巴西艾美尔球虫、猪等孢艾美尔球虫和猪柔嫩艾美尔球虫。
[0023]本专利技术提供的所述分离方法得到的单个球虫在药物筛选和/或药物代谢研究中的应用。
[0024]本专利技术提供的单个球虫的分离方法，是将荧光蛋白基因和靶标基因形成的融合基因整合至球虫子孢子基因组中，将整合后的子孢子进行药物筛选；采用CellCut激光显微切割操作系统对筛选后的卵囊进行单卵囊分选，培养，得到单个球虫。本专利技术首先基于荧光标记使靶标蛋白可视化的原理，通过荧光信号筛选表达靶标蛋白的卵囊，再配合使用精准度较高的MMI的CellCut的激光显微切割操作系统对具有荧光的蛋白进行单个单卵囊分选，单卵囊经培养得到单个球虫。本专利技术提供的方法具有单卵囊分离效率及准确率高的优点。
[0025]同时本专利技术提供的方法采用靶标基因与荧光蛋白融合，而后转染球虫，使靶蛋白可视化，通过观察表达荧光蛋白的卵囊从而确定表达靶标蛋白的卵囊，并且分选后得到的单个卵囊培育的单个球虫模型符合高内涵筛选平台的基本要求，为筛选靶定基因的抑制剂或者激动剂的高通量筛选奠定了坚实的基础。制备的单个球虫模型还可应用于球虫药物的筛选，具有的假阳性低、筛选所需样本少、筛选样本量大、易于标准化、筛选速度快、特异性强等优势。
附图说明
[0026]图1为本专利技术提供的单个球虫的分离方法技术路线图；
[0027]图2为通过Countstar CastorX1人工智能圈选携带有mCherry的球虫；
[0028]图3为通过Countstar CastorX1人工智能圈选携带有EGFP的球虫；
[0029]图4为Countstar CastorX1中明场下人工智能圈选的重铬酸钾溶液中球虫；
[0030]图5为通过Countstar Castor X1中的人工智能圈选的携带有EGFP+mCherry的球
虫，其中转染图形显示为人工智能识别，其中的红圈(表示红色荧光蛋白球虫)和绿圈(表示绿色荧光蛋白球虫)；黄色为含有红、绿双色荧光蛋白的球虫；
[0031]图6为经过MMI CellCut激光显微切割操作系统切割获得的单卵囊。
具体实施方式
[0032]本专利技术提供了一种单个球虫的分离方法，包括以下步骤：
[0033]将荧光蛋白基因和靶标基因形成的融合基因整合至球虫子孢子基因组中，将整合后的子孢子进行药物筛选，得到筛选后的卵囊；
[0034]采用CellCut激光显微切割操作系统对所述筛选后的卵囊进行单卵囊分选，培养，得到单个球虫。
[0035]本专利技术将荧光蛋白基因和靶标基因形成的融合基因整合至球虫子孢子基因组中，将整合后的子孢子进行药物筛选，得到筛选后的卵囊。
[0036]本专利技术对所述球虫的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的球虫的种类即可，例如柔嫩艾美尔球虫、毒害本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单个球虫的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：将荧光蛋白基因和靶标基因形成的融合基因整合至球虫子孢子基因组中，将整合后的子孢子进行药物筛选，得到筛选后的卵囊；采用CellCut激光显微切割操作系统对所述筛选后的卵囊进行单卵囊分选，培养，得到单个球虫。2.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述单卵囊分选时，所述筛选后的卵囊置于活细胞培养皿中；所述活细胞培养皿分为内皿和外皿；所述内皿嵌套在外皿中并且外皿置于内皿的下方。3.根据权利要求2所述分离方法，其特征在于，所述内皿的环壁为金属环，底部由膜密封；所述外皿为普通的细胞培养皿。4.根据权利要求权利要求3所述分离方法，其特征在于，所述单卵囊分选的方法，将所述筛选后的卵囊置于所述内皿中，经荧光观察，用CellCut激光显微切割操作系统进行激光切割表达荧光蛋白的卵囊四周的膜，表达荧光蛋白的单个卵囊落入外皿的培养基中。5.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述荧光蛋白包括以下至少一种：mCherry、EGFP、EYFP和荧光素酶。6.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述靶标基因包括球虫的生物酶、离子通道相关蛋白、受体蛋白、蛋白酶体和细胞骨架相关蛋白。7.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲自刚，付宝权，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：