一种耐酸酵母的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种耐酸酵母的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)选取新鲜的青贮玉米叶片，剪碎后，用无菌水进行浸润，获得菌液；(2)在上述菌液中添加5

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸酵母的筛选方法


[0001]本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一种耐酸酵母的筛选方法。

技术介绍

[0002]饲料青贮是一种用于青饲料中长期保存的加工技术，随着养殖业的不断进步，青贮饲料以动物适口性，营养保存度、转化率等方面的优势逐步替代干饲料，产生了可观的经济效益。饲料青贮最主要的目的是减小青饲料的腐败，丰富饲料的营养组成。植物乳杆菌和酵母由于能够降低发酵体系pH，降低发酵体系的氧含量，能够显著抑制其他细菌、真菌的生长，因此被广泛用于青贮饲料加工。其中，植物乳杆菌将饲草作物中的碳水化合物转化为乳酸，能够显著降低饲草表面pH。研究表明，植物乳杆菌和酵母之间存在协同作用，当植物乳杆菌产酸达到适合酵母繁殖的条件时，酵母开始发酵产生乙醇，酵母可以在消耗乳酸的代谢过程中促进植物乳杆菌的生长，迅速消耗体系中的氧。同时，酵母在青贮发酵前期，可以利用青贮料中的糖分进行生长繁殖，增加饲料中蛋白质、氨基酸的含量，同时生成乙醇等物质，使青贮饲料具有一定的香味，提高适口性。但是，天然酵母对酸性条件敏感，在低pH环境下生长易受到抑制，难以在植物乳杆菌大量繁殖的环境下生存，导致协同发酵难以进行。因此，筛选耐酸性能好，且适合与植物乳杆菌复配的酵母是青贮发酵过程亟待解决的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于克服现有技术缺陷，提供一种耐酸酵母的筛选方法。
[0004]本专利技术的技术方案如下：
[0005]一种耐酸酵母的筛选方法，包括如下步骤：
[0006](1)选取新鲜的青贮玉米叶片，剪碎后，用无菌水进行浸润，获得菌液；
[0007](2)在上述菌液中添加5
×
且pH为6.5的YPD浓缩母液，进行富集培养，获得富集菌液；
[0008](3)将上述富集菌液与5
×
且pH为2.5的YPD浓缩母液，进行筛选培养，获得筛选菌液；
[0009](4)将上述筛选菌液进行稀释，然后涂布于pH为2.5固体酸性YPD平板培养基上进行培养，挑取生长状况较好的典型的单菌落，接种于pH为2.5固体酸性YPD斜面培养基中进行保存。
[0010]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中，将所述青贮玉米叶片剪碎至直径为0.8
‑
1.2cm的碎片。
[0011]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述无菌水与步骤(2)中的YPD浓缩母液的体积比为4:1。
[0012]进一步优选的，所述浸润的时间为2h。
[0013]更进一步优选的，所述步骤(2)的富集培养的条件为：150rpm，30℃。
[0014]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述富集菌液与步骤(3)中的YPD浓缩母液的体
积比为1:4。
[0015]进一步优选的，所述步骤(3)的筛选培养的条件为：150rpm，30℃。
[0016]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(4)中的培养的条件为：30℃，48h。
[0017]上述筛选方法所得的耐酸酵母在制备复合青贮发酵制剂中的应用。
[0018]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述复合青贮发酵制剂由所述耐酸酵母和植物乳杆菌混合制成。
[0019]本专利技术的有益效果是：
[0020]1、本专利技术以饲草表面的原生酵母菌种为出发菌株，通过选择性筛选法得到耐酸酵母，提高了酸性环境下酵母代谢消耗乳酸的能力。
[0021]2、本专利技术所得的耐酸酵母在复配植物乳杆菌后，在青贮过程中能够去除发酵初期青贮池内残留的氧气，为植物乳杆菌发酵产酸抑制有害微生物繁殖创造厌氧条件，降低青贮饲料的发霉率；同时，该耐酸酵母可以利用青贮料中的糖分和乳酸进行生长繁殖，防止青贮饲料pH过低，增加饲料中蛋白质的含量，使青贮饲料具有一定的香味，提高适口性。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例2中所筛选的耐酸酵母在不同初始pH条件下的培养结果照片。
[0023]图2为本专利技术实施例2中非耐酸酵母菌株与植物乳杆菌共培养结果照片。
[0024]图3为本专利技术实施例2中所筛选的耐酸酵母与植物乳杆菌共培养结果照片。
具体实施方式
[0025]以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0026]实施例1：耐酸酵母的筛选
[0027](1)，选取新鲜的青贮玉米叶片100g，剪碎至直径为1cm大小的碎叶片；
[0028](2)，100g新鲜的青贮玉米碎叶片中添加400mL无菌水进行浸润提取菌液2h；
[0029](3)，提取S2所述步骤中的菌液中添加100mLYPD浓缩母液(5
×
，pH为6.5)，转移至1000mL锥形瓶中富集培养48h，培养条件为150rpm，30℃。所用的YPD浓缩母液配方如表1所示；
[0030]表1 YPD培养基母液(5
×
)成分表
[0031][0032](4)，添加100mL S3所述步骤中富集的菌液于400mL酸性YPD浓缩母液(5
×
，添加乳酸调节pH为2.5)，转移至1000mL锥形瓶中培养48h，培养条件为150rpm，30℃。所用的酸性
YPD浓缩母液配方如表2所示；
[0033]表2酸性YPD培养基母液(5
×
)成分表
[0034][0035](5)，通过稀释涂布法将S4所述步骤中培养的菌液涂布于固体酸性YPD平板(添加乳酸调节pH为2.5)培养48h，培养条件为30℃。所用的酸性YPD固体培养基配方如表3所示；
[0036]表3酸性YPD固体培养基成分表
[0037][0038](6)，挑取S5所述步骤中生长状况较好的典型的单菌落，接种到酸性YPD固体斜面保藏，经16S RNA鉴定菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0039]实施例2：耐酸酵母的培养以及与非耐酸醇母菌株的对比
[0040](1)MRS培养基的准备
[0041]于250mL的锥形瓶中配置100mL MRS液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，水1000mL)。使用1M HCl溶液和1M NaOH溶液调节不同初始pH条件的MRS液体培养基后121℃灭菌20min。
[0042](2)酵母的培养
[0043]挑取实施例1中所得耐酸酵母的单菌落于上述不同pH条件的MRS液体培养基中，于30℃、150rpm恒温震荡摇床中培养24h，培养结束后测定酵母在不同pH条件下生长情况，并以OD
600
表示样品中酵母数量(图1)。
[0044]如图1所示，实施例1中所得的耐酸酵母在发酵培养基初始pH值为3时，生物量与pH
在6～7时基本一致，未受到低pH的明显影响，当初始pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐酸酵母的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)选取新鲜的青贮玉米叶片，剪碎后，用无菌水进行浸润，获得菌液；(2)在上述菌液中添加5
×
且pH为6.5的YPD浓缩母液，进行富集培养，获得富集菌液；(3)将上述富集菌液与5
×
且pH为2.5的YPD浓缩母液，进行筛选培养，获得筛选菌液；(4)将上述筛选菌液进行稀释，然后涂布于pH为2.5固体酸性YPD平板培养基上进行培养，挑取生长状况较好的典型的单菌落，接种于pH为2.5固体酸性YPD斜面培养基中进行保存。2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将所述青贮玉米叶片剪碎至直径为0.8
‑
1.2cm的碎片。3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述无...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈锦良，卢英华，沈亮，邵文尧，段然，陈婷婷，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：