用于植物病原交链格孢的RPA-LFD引物及检测法制造技术

本发明专利技术属于生物技术与植物病害流行学领域，涉及重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD)检测用于植物病原交链格孢的重组酶聚合酶扩增引物组及其使用方法，属于植物病害流行学、动态监测及预警的技术领域。本发明专利技术公开了一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
用于植物病原交链格孢的RPA
‑
LFD引物及检测法


[0001]本专利技术属于生物技术与植物病害流行学领域，涉及重组酶聚合酶扩增(recombinase ploymerase amplication,RPA)技术结合侧向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测用于植物病原交链格孢的重组酶聚合酶扩增引物组及其使用方法，属于植物病害流行学、动态监测及预警的


技术介绍

[0002]烟草赤星病是一种危害叶部的真菌性病害，基本发生在烟草生长中后期，其在世界各地烟区均有不同程度的发生，是目前世界烟草生产上最大的病害之一。交链格孢(Alternaria alternata)可引起烟草赤星病，被感染的植物下部叶初生圆形深褐色小点，后扩展为近圆形病斑，有同心轮纹，直径可达1cm以上，边缘有鲜黄色晕圈，病斑质脆易破裂。由于烟草赤星病是烟草生长中后期发生的叶斑类病害，因此严重影响烟叶的产量与质量。
[0003]传统的病害识别局限于病害发病症状、病原菌的生物学形态等特点。通过叶斑大小、颜色、病原菌分生孢子梗着生方式、形状以及分生孢子形态和大小等特点进行识别赤星病。随着分子技术的发展，聚合酶链反应(PCR)、q
‑
PCR等分子检测技术已经成功应用于检测病原体。然而，这些识别手段具有片面性、耗时性，或者需要昂贵的仪器，严重的限制了烟草中后期叶斑类病害的快速识别诊断。因此，开发快速简便的病原菌检测技术对农业生产具有重要意义。
[0004]环介导等温扩增(Loop
‑
mediated isothermal amplification,LAMP)是由是一种新型、方便快捷、灵敏度极高且廉价的核酸扩增方法，在恒温条件下即可完成反应。但LAMP检测需要的温度较高(40
‑
60℃)，反应时间较长(1小时左右)。目前在植物病原真菌的检测领域灰霉、稻瘟、恶苗等多种病害的LAMP检测已经被报道。重组酶聚合酶扩增法(RPA)是一种新的核酸等温扩增方法，与传统的PCR扩增法和LAMP检测相比，其显著的优势是更宽的反应温度范围和更短的反应时间。通过与荧光基团标记的反应，RPA技术与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合，实现扩增产物的可视化检测，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测，可以实现病原物高特异性、高灵敏度的可视化快速检测，具有极为广泛的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于检测植物病原交链格孢的RPA
‑
LFD引物及检测法。
[0006]为了解决上述的技术问题，本专利技术提供一种用于快速检测交链格孢A.alternata的组合物，包括用于检测的引物对和探针；
[0007]所述引物对：
[0008]上游引物：5
’‑
CTGATTTTCTCACCGTCAATGTCACCATCAAG
‑3’
[0009]下游引物：5
’‑
Biotin
‑
TCAGTGGAGATGTTGGGAATAGAGATGTAGCTG
‑3’
[0010]探针：5
’‑6‑
FAM
‑
GCAGCGGGCTTCGTGGCTTTCGCCTGCTGCTGC/idSp/GCTTGGGGCGCATAT
‑
Spacer C3
‑3’
[0011]本专利技术同时还提供了一种快速检测植物交链格孢的RPA
‑
LFD试剂盒，所述RPA
‑
LFD试剂盒包括上述组合物，还包括反应A buffer、B buffer、HybriDetect胶体金试纸条、ddH2O。即，本专利技术所述的RPA
‑
LFD试剂盒，包括重组酶聚合酶扩增引物混合液和LFD引物混合液，浓度为10μM的正向引物、10μM的反向引物、A buffer、B buffer、HybriDetect胶体金试纸条、ddH2O。检测溶液共48μL，加入2μL待测DNA模版(浓度为10ng/μL)，构成50μL检测反应体系。
[0012]50μL检测反应体系中含有A buffer 29.4μL、10μM的正向引物2μL，10μM的反向引物2μL，10μM的探针0.6μL，B buffer 2.5μL，DNA模板2μL，ddH2O补足至50μL。
[0013]本专利技术还提供了利用上述试剂盒快速检测植物(例如烟草)病菌的方法，包括以下步骤：
[0014]1)提取样本核酸；
[0015]所述样本为植物叶片；
[0016]植物包括烟草；
[0017]2)采用组合物对步骤1)提取的样本核酸进行RPA扩增反应，50μL体系中含有A buffer29.4μL、10μM的正向引物2μL，10μM的反向引物2μL，10μM的探针0.6μL，B buffer 2.5μL，DNA模板2μL，ddH2O补足至50μL；RPA
‑
LFD扩增反应程序为：39℃，10min；
[0018]3)取10μL步骤2)得到的反应产物加入至190μL ddH2O中，混匀后取50μL稀释后的扩增产物滴入Hybri Detect胶体金试纸条加样孔，5min内记录控制线和检测线，判定试验结果；
[0019]若控制线可见，检测线不可见，此为阴性结果，即，判定DNA模板对应的待测物中不含有植物病原交链格孢；
[0020]若检测线和控制线均可见，此为阳性结果；即，判定DNA模板对应的待测物中含有植物病原交链格孢；
[0021]若检测线和控制线均不可见，需要重新进行检测。
[0022]本专利技术的专利技术过程包括：
[0023](1)根据交链格孢A.alternata的基因组序列与其他菌种间的差异位点来设计特异性引物和探针；
[0024](2)引物的筛选；
[0025](3)引物和探针的特异性；
[0026](4)RPA
‑
LFD反应条件的优化；
[0027](5)RPA
‑
LFD的检测灵敏度。
[0028]具体如下：
[0029]1.引物和探针的设计
[0030]选择烟草中常见的植物病原菌属：来设计特异性引物。每对引物设计的长度为31
‑
34bp，引物太短会影响扩增速度和灵敏度，扩增的长度为150
‑
300bp，太长的片段会形成二级结构，从而导致影响扩增。本专利技术通过对Alternaria alternata的ALM1基因与其他常见
病原菌的序列比对，根据序列差异，设计多对引物，其中3对引物的序列如表1：
[0031]表1引物序列信息
[0032][0033]2.引物的筛选
[0034]PCR体系总体积为25μL，12.5μLTaq Master Mix，1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA
‑
LFD法检测植物病原交链格孢的组合物，其特征在于：组合物包括检测病原菌的引物对和探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述引物对：上游引物：5
’‑
CTGATTTTCTCACCGTCAATGTCACCATCAAG
‑3’
下游引物：5
’‑
Biotin
‑
TCAGTGGAGATGTTGGGAATAGAGATGTAGCTG
‑3’
探针：5
’‑6‑
FAM
‑
GCAGCGGGCTTCGTGGCTTTCGCCTGCTGCTGC/idSp/GCTTGGGGCG CATAT
‑
Spacer C3
‑3’
。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述下游引物5
’
端使用Biotin标记，所述探针5
’
端的荧光基团为FAM，3
’
端的荧光基团为C3 Spacer。4.一种用于快速检测植物交链格孢的RPA
‑
LFD试剂盒，其特征在于：所述RPA
‑
LFD试剂盒包括如权利要求1～3任一所述的组合物。5.根据权利要求4所述的RPA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传清，陈杨颖，汪汉城，刘亚慧，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：