一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法技术

本发明专利技术涉及一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法，以百香果子叶为实验材料，利用酶裂解法获得活性较高的叶肉原生质体，随后利用PEG介导的转化方法将外源基因高效转入百香果原生质体进行瞬时表达。包括(1)分离，选取生长状况良好的百香果植株子叶，去除下表皮；将除去下表皮的子叶放入酶解液中，得到含叶肉原生质体的酶解混合液；洗涤酶解混合液、过滤离心得到原生质体沉淀，重悬后获得原生质体悬浮液。(2)转化，利用PEG介导的转化方法成功将带有GFP标签的质粒转化到百香果原生质体中，转化效率达到60％。本发明专利技术建立了第一个高效的百香果原生质体分离和转化方法。该方法将应用于百香果的各种生物学研究，如基因功能分析、基因组编辑、蛋白质转运与定位、蛋白质

【技术实现步骤摘要】
一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法


[0001]本专利技术涉及原生质体分离及转化
，具体是指一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法。

技术介绍

[0002]百香果又名西番莲(Passifloraedulis),是西番莲科、西番莲属草质藤本植物。百香果含有130多种芳香物质，具有独特的香味，且富含多种维生素以及花青素等物质，营养价值高，还具有清热解毒、利咽生津、美容、润肠通便等功效。
[0003]原生质体是指除去细胞壁，由质膜包被，具有活力的裸露细胞。原生质体最早在1892年被Klercker等利用机械法从藻类植物中分离出来。直到1960年，Cocking才利用纤维素酶粗制剂从番茄(Solanumlycopersicum)根尖中分离出大量有活力的原生质体，为植物原生质体的分离技术开辟了道路(Cocking,1960)。到1968年，纤维素酶和果胶酶投入市场，自此，植物原生质体领域进入迅速发展的阶段。目前在原生质体的研究和应用方面已取得了巨大的进展，原生质体系统被广泛用于生理、生化、遗传、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、代谢组学的研究中，同时植物原生质体系对于育种和生物制药方面也有重要作用。
[0004]目前，尚未有研究报道百香果叶肉原生质体的分离技术，百香果仍缺乏快速高效的原生质体转化体系，这限制了对百香果遗传资源库的充分探索，以及对百香果基因、蛋白质定位和蛋白质相互作用的研究。所以建立适用于百香果的原生质体分离与转化体系十分重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术要填补上述技术空白，提供一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：
[0007]一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法，包括以下步骤：
[0008]S1、选取生长状况良好的百香果植株子叶，将纸质胶带贴在上表皮表面，轻轻按压，从没有粘在胶带上的叶片那边小心地撕掉下表皮，剥皮后的叶片仍然粘在纸质胶带上，剪成小块，转移到含有2mL酶解液的培养皿中，用锡纸盖住培养皿，室温下在水平摇床(45rpm)上酶解1
‑
2小时，原生质体释放到溶液中后，呈现出明显的绿色；
[0009]S2、加入2mL冰的W5溶液，混匀后用100μm尼龙膜过滤，1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清，保留原生质体颗粒；
[0010]S3、水平地将1mL冰的W5溶液慢慢加入试管的内侧，轻轻地旋转使原生质体悬浮，1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清；
[0011]S4、加入300μL冰的W5溶液使原生质体悬浮，吸10μL至血球计数板中计数，剩余的冰置30分钟；
[0012]S5、小心移出上清，在室温下用MMg溶液重悬原生质体至密度为2～5
×
105/mL；得到百香果原生质体悬浮液；
[0013]S6、在2mL圆底离心管底部加入30μL的百香果原生质体悬浮液，加入3μLpGreen0029
‑
GFP质粒，轻轻晃匀后加入33μL新配制的PEG溶液，再次轻轻晃匀，室温孵育10分钟；
[0014]S7、加入120μLW5停止转染，并温和地晃动使其混匀；
[0015]S8、1200rpm离心2分钟，小心吸掉上清，用60μLW5溶液悬浮原生质体；
[0016]S9、1200rpm离心2分钟，吸掉上清，最后加入50μl的W5，在黑暗条件下培养。
[0017]优选地，S6步骤中所述pGreen0029
‑
GFP质粒的质粒浓度调整为800
‑
1000ng/μL且在
‑
20℃保存。
[0018]优选地，S1步骤中所述酶解液包括：纤维素酶R10、离析酶R10、甘露醇、CaCl2、KCl、MES和牛血清蛋白。
[0019]优选地，S2步骤中所述W5溶液包括：NaCl、CaCl2、KCl、葡萄糖和MES。
[0020]优选地，S5步骤中所述MMg溶液包括甘露醇、MgCl2和MES。
[0021]优选地，S6步骤中PEG溶液包括PEG4000、CaCl2和甘露醇。
[0022]采用以上结构后，本专利技术具有如下优点：
[0023]本专利技术以百香果子叶为实验材料，利用酶裂解法获得活性较高的叶肉原生质体。随后，我们利用PEG介导的转化方法成功将带有GFP标签的质粒转化到百香果原生质体中，转化效率达到60％。本专利技术建立了第一个高效的百香果原生质体分离和转化方法。
[0024]本专利技术所提供的方法操作简单，得到的百香果原生质体产量高、活性高、转化效率高，具有广阔的应用前景，如：基因功能分析、基因组编辑、蛋白质转运与定位、蛋白质
‑
蛋白质相互作用等。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0026]图1是本专利技术的原生质体分离步骤示意图。
[0027]图2是本专利技术的二乙酸荧光素(FDA)染色后的百香果原生质体示意图。
[0028]图3是本专利技术的PEG介导的百香果原生质体的瞬时转化示意图。
具体实施方式
[0029]下面结合说明书附图及具体实施对本专利技术做出进一步详细阐述，所述实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
[0030]结合附图1
‑
图3，一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法，包括以下步骤：
[0031]S1、选取生长状况良好的百香果植株子叶，将纸质胶带贴在上表皮表面，轻轻按压，从没有粘在胶带上的叶片那边小心地撕掉下表皮，剥皮后的叶片仍然粘在纸质胶带上，剪成小块，转移到含有2mL酶解液的培养皿中，用锡纸盖住培养皿，室温下在水平摇床上酶解1
‑
2小时，原生质体释放到溶液中后，呈现出明显的绿色；
[0032]S2、加入2mL冰的W5溶液，混匀后用100μm尼龙膜过滤，1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清，保留原生质体颗粒；
[0033]S3、水平地将1mL冰的W5溶液慢慢加入试管的内侧，轻轻地旋转使原生质体悬浮，
1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清；
[0034]S4、加入300μL冰的W5溶液使原生质体悬浮，吸10μL至血球计数板中计数，剩余的冰置30分钟；
[0035]S5、小心移出上清，在室温下用MMg溶液重悬原生质体至密度为2～5
×
105/mL；得到百香果原生质体悬浮液；
[0036]S6、在2mL圆底离心管底部加入30μL的百香果原生质体悬浮液，加入3μLpGreen0029
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GFP质粒，轻轻晃匀后加入33μL新配制的PEG溶液，再次轻轻晃匀，室温孵育10分钟；
[0037]S7、加入120μLW5停止转染，并温和地晃动使其混匀；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、选取生长状况良好的百香果植株子叶，将纸质胶带贴在上表皮表面，轻轻按压，从没有粘在胶带上的叶片那边小心地撕掉下表皮，剥皮后的叶片仍然粘在纸质胶带上，剪成小块，转移到含有2mL酶解液的培养皿中，用锡纸盖住培养皿，室温下在水平摇床45rpm上酶解1
‑
2小时，原生质体释放到溶液中后，呈现出明显的绿色；S2、加入2mL冰的W5溶液，混匀后用100μm尼龙膜过滤，1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清，保留原生质体颗粒；S3、水平地将1mL冰的W5溶液慢慢加入试管的内侧，轻轻地旋转使原生质体悬浮，1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清；S4、加入300μL冰的W5溶液使原生质体悬浮，吸10μL至血球计数板中计数，剩余的冰置30分钟；S5、小心移出上清，在室温下用MMg溶液重悬原生质体至密度为2～5
×
105/mL；得到百香果原生质体悬浮液；S6、在2mL圆底离心管底部加入30μL的百香果原生质体悬浮液，加入3μLpGreen0029
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GFP质粒，轻轻晃匀后加入33μL新配制的PEG溶液，再次轻轻晃匀，室温孵育10分钟；S7、加入12...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴兆基，王琳淅，崔红光，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：