甘蔗悬浮单细胞系原生质体的分离纯化及培养方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供甘蔗悬浮单细胞系原生质体的分离纯化及培养方法，包括：愈伤组织的诱导及继代培养；胚性悬浮细胞的获取；悬浮单细胞的获取；指数生长期的细胞团的获取；原生质体的制备；原生质体的纯化；原生质体的培养；在将悬浮单细胞进行分化酶解时，以指数生长期的细胞团进行原生质体的酶解，酶解过程优选了不同的酶液、酶液浓度条件，获得产量和活力较高的原生质体；在获得纯化的原生质体后，通过优化渗透压、激素组合、激素浓度等条件培养原生质体，分裂频率达25.08％、植板率达14.52％。本发明专利技术利用甘蔗的单细胞悬浮系获得原生质体，为甘蔗悬浮单细胞原生质体培养、体细胞杂交及其他遗传改良研究奠定了基础。细胞杂交及其他遗传改良研究奠定了基础。细胞杂交及其他遗传改良研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
甘蔗悬浮单细胞系原生质体的分离纯化及培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及甘蔗悬浮单细胞系原生质体的分离纯化及培养方法。

技术介绍

[0002]甘蔗作为我国重要的经济作物，一直是食糖的主要来源，甘蔗糖业是我国食糖工业的重要支柱。然而蔗糖生产中存在着糖料蔗品种单一，选育的新品种不能满足甘蔗生产需求等问题，严重影响了蔗糖业健康稳定发展和竞争能力的进一步提高。但甘蔗是一种喜温作物，通常已无性繁殖为主，在广西、云南等大多地域栽培的甘蔗由于温度及日照的条件限制，无法形成完整的花穗，且花穗中的花粉孢子几乎没有育性，这使得甘蔗种质资源创新和良种繁育工作一直没有取得突破性的进展。而现代生物技术的发展和甘蔗体细胞杂交技术的不断成熟，为甘蔗育种的发展提供了新思路和新方法。
[0003]细胞悬浮培养(Cell suspension culture)是组织培养研究中的一个关键内容。细胞悬浮培养指的是利用植物的离体材料(如根尖、茎尖、叶片等)获得愈伤组织后进行继代培养，以使其进一步形成未分化的、活性高的、疏松的愈伤组织或者其他易于分散的组织后，将其置于液体培养基中振荡分散进行悬浮培养，以此得到保持良好的生长状态且可以不断增殖的游离单细胞或小细胞团。这些单细胞或细胞团被称为悬浮细胞系(Suspension cell line)或悬浮系。而大小均一、细胞质浓厚的悬浮单细胞与紧密聚集的细胞团相比，在育种上更具有重要意义。由于利用此技术培养得到的细胞具有细胞生长迅速，细胞状态相对一致，重复性好，条件易于控制，细胞或细胞团大小均匀且分散性好，培养周期短等优点，不仅被广泛用于分子生物学、发育生物学、生物化学、细胞学、遗传学、生理学等多个领域的研究，还被直接用于在细胞水平上筛选突变体，基因大分子物质的转移，次生代谢产物的生产，植物无性系的建立，细胞杂交，原生质体分离、培养和融合等。因此，植物细胞悬浮培养技术自20世纪80年代发展至今，已成为了生物技术研究开发的新热点，是公认的一种应用潜力巨大的细胞离体培养技术，并被广泛应用于植物新品种的培育。
[0004]原生质体是细胞壁已被酶促或物理去除的植物体细胞，可以维持整个植物的生理和细胞过程。因此，原生质体实验系统已成为一种强大的功能基因组学工具，用于研究涉及植物生理学、先天免疫、生长和发育的蛋白质
‑
蛋白质相互作用、蛋白质定位和信号通路。因此，原生质体已成为分子和细胞水平上研究遗传信息的结合点，同时也成为研究植物生理过程的重要材料。
[0005]甘蔗原生质体的研究始于20世纪7、80年代。1986年，法国的Srinivasan和Vasil首次报道甘蔗幼叶愈伤组织悬浮细胞分离的原生质体培养得到再生植株。随后许多研究者从不同的甘蔗材料中获得了原生质体再生植株。廖兆周等参考了Paul,W.J.T.和HO,W.J.等人建立的甘蔗悬浮细胞系，以此获得分离原生质体的起始材料，但他们的实验证明，使用此细胞系分离出来的原生质体极难实现原生质体的再生，可能原因是甘蔗原生质体再生植株事例不多且难以重复其结果。时至今日，关于利用甘蔗细胞悬浮系为起始材料来制备原生质
体，且原生质体培养出再生植株的报道仍然很少。洪翠选用5种基因型不同的甘蔗作为供试材料，以甘蔗幼叶诱导形成胚性愈伤组织进行悬浮培养,用于分离原生质体，但都未得到再生植株，且其中四种基因型得愈伤组织分化和继代效果较差。可能原因是目前建立的甘蔗悬浮细胞系不够成熟且年代久远，并不适用于当下的甘蔗品种。也可能是因为原生质体的分离与培养条件还未有较为完善的体系，从而导致原生质体在酶解和培养的过程中受到严重损伤，从而影响后续的培养，无法形成再生植株。
[0006]细胞壁重建是原生质体培养的开始，重建了细胞璧,意味着原生质体重新进入了细胞状态，对于叶肉原生质体、下胚轴原生质体等来源于植物组织或器官的原生质体来说，通过细胞壁重建，完成了成组织/器官到单细胞的变化。而经分离纯化后的原生质体需要在适宜的培养基和培养条件下培养才能再生新的细胞壁，随后细胞才能进行裂，并进一步形成新的细胞团和愈伤组织，最后由愈伤组织通过器官发生途径或胚状体途径再生植株。材料的基因型、材料类型、原生质体的分离材料、原生质体的分离方法、原生质体的培养条件(包括培养起始密度、培养基、培养方法、渗透压稳定剂浓度、激素、光照、温度以及其他环境因素)等诸多的因素与能否成功将原生质体培育成再生植株息息相关。目前，以甘蔗悬浮单细胞系为材料，获得原生质体，并成功对该原生质体进行培养尚具有较大的难度。

技术实现思路

[0007]本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供甘蔗悬浮单细胞系原生质体的分离纯化及培养方法，本专利技术以甘蔗细胞悬浮系为起始材料来制备原生质体，且将原生质体培养出再生植株，为甘蔗ROC22悬浮单细胞原生质体培养、体细胞杂交及其他遗传改良研究奠定基础。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0009]甘蔗悬浮单细胞系原生质体的分离纯化及培养方法，包括以下步骤：
[0010](1)愈伤组织的诱导及继代培养：选取甘蔗伸长初期的尾鞘作为诱导愈伤组织的材料，剥去外面几层叶鞘，消毒后于无菌环境中切除外层叶鞘，取最里面几层距生长点4
‑
6cm的淡黄色幼叶，切成组织块，置于愈伤组织诱导培养基中培养，得到松散的愈伤组织；再在MS诱导培养基中对松散的愈伤组织进行继代增殖培养，得到继代愈伤组织；
[0011](2)胚性悬浮细胞的获取：将继代愈伤组织接种在悬浮培养基中进行液体悬浮培养，悬浮培养基中加有悬浮培养液，于摇床中暗培养，每7天继代一次，连续继代6
‑
8次，每个继代周期结束时，将悬浮培养物静置一段时间后，除去上层培养液，加入新鲜的悬浮培养液；继代培养结束得到胚性悬浮细胞；所述悬浮培养液的组分为：MS+2,4
‑
D 2.0mg/L+蔗糖30g/L，调pH5.5
‑
6.0；
[0012](3)悬浮单细胞的获取：将所述胚性悬浮细胞摇匀后静置一段时间，将中间层的细胞及培养液用细胞筛过滤，滤液中即为胚性悬浮单细胞；
[0013](4)将胚性悬浮单细胞在培养液为MS+2,4
‑
D 2.0mg/L+蔗糖30g/L，调pH5.5
‑
6.0的培养基中悬浮振荡继代培养，得到指数生长期的细胞团；
[0014](5)原生质体的制备：将步骤(4)培养后的混合物离心去除培养液，加入基本酶液，在黑暗条件下，于摇床中振荡酶解；
[0015](6)原生质体的纯化：
①
将步骤(5)酶解后的产物在水平方向上缓慢摇晃，而后静
置1
‑
5min，将酶解后的产物用吸管轻柔吸打通过100目尼龙筛过滤至10ml玻璃离心管后，再通过200目钢筛二次过滤至离心管，用MR漂洗液配平玻璃离心管，在室温下离心；
②
离心结束后用吸管将上层培养液吸出，加入2mlMR漂洗液重新悬浮沉淀并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘蔗悬浮单细胞系原生质体的分离纯化及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)愈伤组织的诱导及继代培养：选取甘蔗伸长初期的尾鞘作为诱导愈伤组织的材料，剥去外面几层叶鞘，消毒后于无菌环境中切除外层叶鞘，取最里面几层距生长点4
‑
6cm的淡黄色幼叶，切成组织块，置于愈伤组织诱导培养基中培养，得到松散的愈伤组织；再在MS诱导培养基中对松散的愈伤组织进行继代增殖培养，得到继代愈伤组织；(2)胚性悬浮细胞的获取：将继代愈伤组织接种在悬浮培养基中进行液体悬浮培养，悬浮培养基中加有悬浮培养液，于摇床中暗培养，每7天继代一次，连续继代6
‑
8次，每个继代周期结束时，将悬浮培养物静置一段时间后，除去上层培养液，加入新鲜的悬浮培养液；继代培养结束得到胚性悬浮细胞；所述悬浮培养液的组分为：MS+2,4
‑
D 2.0mg/L+蔗糖30g/L，调pH5.5
‑
6.0；(3)悬浮单细胞的获取：将所述胚性悬浮细胞摇匀后静置一段时间，将中间层的细胞及培养液用细胞筛过滤，滤液中即为胚性悬浮单细胞；(4)将胚性悬浮单细胞在培养液为MS+2,4
‑
D 2mg/L+蔗糖30g/L，调pH5.5
‑
6.0的培养基中悬浮振荡继代培养，得到指数生长期的细胞团；(5)原生质体的制备：将步骤(4)培养后的混合物离心去除培养液，加入基本酶液，在黑暗条件下，于摇床中振荡酶解；(6)原生质体的纯化：
①
将步骤(5)酶解后的产物在水平方向上缓慢摇晃，而后静置1
‑
5min，将酶解后的产物用吸管轻柔吸打通过100目尼龙筛过滤至10ml玻璃离心管后，再通过200目钢筛二次过滤至离心管，用MR漂洗液配平玻璃离心管，在室温下离心；
②
离心结束后用吸管将上层培养液吸出，加入2mlMR漂洗液重新悬浮沉淀并用吸管轻柔吸打入含有7mlMP漂洗液的10ml玻璃离心管中，用MR漂洗液配平玻璃离心管，在室温下离心；
③
离心结束后用吸管轻柔吸取界面处的原生质体层并轻柔吸打入含有7ml 19％MP漂洗液的10ml玻璃离心管中，用MPS漂洗液配平玻璃离心管，在室温下离心；
④
离心结束后用吸管轻柔将玻璃离心管中的MPS漂洗液吸出，加入2ml MPS漂洗液重新悬浮沉淀，并将原生质体浓度调整至4
×
105/mL
‑6×
105/mL；(7)原生质体的培养：将步骤(6)纯化且浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：李素丽，王瑞，张德梅，袁帅，李馨竹，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：