一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，步骤如下：将甘草外植体进行悬浮培养，得到细胞悬浮液；向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液；本发明专利技术公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，将甘草外植体直接获取悬浮细胞，方法简单、容易操作，耗费时间周期短、且增殖效率高，可在短时间内获得大量甘草单细胞，通过添加表面活性剂，可以使甘草细胞内的次生代谢物质释放到培养基中，且保证较高的细胞成活率，可以在更低的时间及经济成本上更加高效地生产甘草总黄酮。成本上更加高效地生产甘草总黄酮。成本上更加高效地生产甘草总黄酮。

【技术实现步骤摘要】
一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法


[0001]本专利技术涉及涉及细胞领域，尤其是涉及一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法。

技术介绍

[0002]甘草（Glycyrrhiza）又名甜草（东北、内蒙古），甜草根（陕西），为豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papiliantae Taub.）甘草属多年生草本植物。近年来，各国学者对甘草化学成分进行了大量的研究，已经从甘草中分离得到约170 多种化学成分；其中，黄酮类和三萜类化合物是主要成分，此外，还有甘草多糖、多种氨基酸、有机酸以及少量的生物碱、香豆素和木质素等。
[0003]随着对甘草药理作用的深入研究，发现甘草总黄酮类化合物具有多种生物活性，除了消炎、抗菌、抗变态等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、防肿瘤等方面也有明显的生物活性，目前已成为甘草研究的热点。
[0004]目前有关甘草的细胞培养体系及其次生代谢产物甘草总黄酮主要的培养方式是悬浮培养，当细胞生长量达到最大时，采用细胞破碎的方式使胞内次生代谢产物释放出来，再进一步地提取纯化，在这个过程中，细胞直接死亡，不能可持续的生产甘草总黄酮。
[0005]因此，如何使甘草细胞中的甘草总黄酮有效地释放到液体培养基中，并且保证甘草细胞存活，能够进行可持续甘草总黄酮的生产活动成为迫切需要解决的问题。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，可以使得甘草细胞中的甘草总黄酮有效地释放到液体培养基中，在此基础上保证甘草细胞存活，能够进行可持续甘草总黄酮的生产活动。
[0007]第一方面，本申请提供一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，采用如下的技术方案：一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，步骤如下：将甘草外植体进行悬浮培养，得到细胞悬浮液；向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液。
[0008]优选的，将甘草外植体进行悬浮培养的步骤如下：将甘草外植体放入至液体培养基中进行悬浮培养，得到细胞悬浮液。
[0009]优选的，甘草外植体与液体培养基的质量体积比为5g/L
‑
25g/L。
[0010]优选的，悬浮培养的时间为20
‑
50天。
[0011]优选的，悬浮培养的条件为25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100
‑
120rpm。
[0012]本申请中的甘草外植体包括甘草外植体的根、茎、叶、胚根、子叶等。本申请中通过
将甘草外植体进行悬浮培养，甘草外植体在液体培养基中发生脱分化，由于甘草外植体是在液体培养基中培养，所以直接获得了细胞悬浮液，而常规的细胞悬浮培养需要利用甘草外植体诱导愈伤组织（30
‑
50天），再用愈伤组织进行悬浮培养获得细胞悬浮液（20
‑
50天），本申请的培养方式与常规悬浮培养相比缩短了培养时间。
[0013]优选的，表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温
‑
20中任意一种；加入的表面活性剂可以在维持细胞正常生长的情况下增加其表面活性，使细胞内次生代谢物质释放出来。
[0014]优选的，加入表面活性剂后的细胞悬浮体系中，表面活性剂的质量浓度为0
‑
20%，且不为0。
[0015]优选的，向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养的时间为10
‑
15天。
[0016]优选的，向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，培养的条件为25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100
‑
120rpm。
[0017]优选的，液体培养基以MS为基本培养基，质量浓度为4.4g/L，6
‑
BA质量浓度为0.3
‑
1.0 mg/L，NAA质量浓度为0.3
‑
1.0 mg/L，2,4
‑
D质量浓度为0.3
‑
1.0 mg/L，蔗糖30g/L，PH值为5.8
‑
6.0。
[0018]本申请中将甘草外植体直接获取悬浮细胞，方法简单、容易操作，耗费时间周期短、且增殖效率高，可在短时间内获得大量甘草单细胞，通过添加表面活性剂，可以使甘草单细胞内的次生代谢物质释放到培养基中，且保证较高的细胞成活率，可以在更低的时间及经济成本上更加高效地生产甘草总黄酮。
[0019]在一个具体的可实施方案中，一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，步骤如下：（1）甘草无菌苗的获取；选择饱满无病虫害的光果甘草种子，用体积浓度为75%的酒精消毒3 min，再用体积浓度为10%的次氯酸钠消毒15 min，无菌水清洗3次后，用滤纸吸干种子水分，接种到MS培养基中使其萌发，得到光果甘草无菌苗。
[0020]（2）甘草下胚轴液体培养以光果甘草无菌苗为材料，切取其下胚轴，直接放入液体培养基中，在25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100
‑
120rpm下进行悬浮震荡培养20
‑
50天，得到稳定的细胞悬浮液。
[0021]光果甘草无菌苗下胚轴与液体培养基的质量体积比为5g/L
‑
25g/L。
[0022]液体培养基以MS为基本培养基，质量浓度为4.4g/L，6
‑
BA质量浓度为0.3
‑
1.0 mg/L，NAA质量浓度为0.3
‑
1.0 mg/L，2,4
‑
D质量浓度为0.3
‑
1.0 mg/L，蔗糖30g/L，PH值为5.8
‑
6.0。
[0023]甘草下胚轴液体培养的过程如下：光果甘草无菌苗下胚轴进行培养至1周时，下胚轴开始膨大，并有少量细胞悬出；培养至3
‑
4周时，细胞分裂生长速度较快，此时开始传代培养，之后每2
‑
3周传代一次，传代两次后获得稳定的细胞悬浮液。
[0024]（3）表面活性剂浓度的确定向细胞悬浮液中加入表面活性剂，在25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100
‑
120rpm下进行培养10
‑
15天，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液。
[0025]其中，表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温
‑
20中任意一种。
[0026]加入表面活性剂后的细胞悬浮体系中，表面活性剂的质量浓度为0
‑
20%，且不为0。
[0027]1.甘草中的总黄酮成分的检测与分离纯化甘草中的总黄酮成分的检测：对制备得到的含有甘草总黄酮的细胞悬浮液中的黄酮含量进行测定。
[0028]分离纯化：将含有甘草总本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于，步骤如下：将甘草外植体进行悬浮培养，得到细胞悬浮液；向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液。2.根据权利要求1所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于，将甘草外植体进行悬浮培养的步骤如下：将甘草外植体放入至液体培养基中进行悬浮培养，得到细胞悬浮液。3.根据权利要求2所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于，甘草外植体与液体培养基的质量体积比为5g/L
‑
25g/L。4.根据权利要求1或2所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于：悬浮培养的时间为20
‑
50...

【专利技术属性】
技术研发人员：位明君，赵永军，邵瞳，谭国昇，姚睿，潘如雪，
申请(专利权)人：浙江觅得优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：