枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用技术

本实发明专利技术涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用。本发明专利技术通过对枸杞子干果进行清洗然后PBS缓冲液浸泡、破壁机研磨、高速离心、超速离心、蔗糖梯度离心纯化和PBS缓冲液清洗去糖的步骤制备得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。本发明专利技术制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以应用于促进诱导巨噬细胞M1的极化，从而促进适应性免疫应答。促进适应性免疫应答。促进适应性免疫应答。

【技术实现步骤摘要】
枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用


[0001]本实专利技术涉及细胞生物学
，尤其涉及一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡主要包括外泌体和微囊泡，是一种由活细胞分泌的直径位于30nm～1000nm之间的微小囊泡，包含细胞来源的核酸和蛋白等活性分子，具有介导细胞间通讯等功能，也是理想的液体活检标志物和治疗载体。中草药细胞外囊泡的研究和应用符合国家对促进中医药传承创新发展和中医药科技战略发展目标的要求，同时也是对中医药现代化事业的追求。
[0003]作为中草药领域的研究新星，植物EVs具有天然纳米载体的独特形态和组成特征，富含生物活性脂质，蛋白质，RNA和其他药理活性分子。这些特性使植物EVs在免疫调节，抗肿瘤，再生和抗炎等疾病治疗过程中都能发挥重要作用，并能够穿过多种严格的如肿瘤包膜和血脑屏障的生物屏障，向各种靶向器官输送药物。
[0004]枸杞子属茄科植物枸杞的成熟果实，其被列为“药食同源”的品种，枸杞子可以增强人体免疫力、抗衰老，对男性的生殖系统也有很好的保护作用；另外还可以滋润皮肤，也深受女性人群的喜爱；在日常生活中很是常见，人们经常会用枸杞泡茶饮用，对机体的健康起到很大的作用。传统中医认为枸杞子具有滋补肝肾之阴，可治疗由于肝肾阴虚引起的视力障碍、消渴等症。现代医学认为枸杞子具有提高免疫力和抗肿瘤的重要作用，尤其作为宁夏地区的特产，同时也具有更加重要的经济价值。细胞外囊泡包含许多蛋白质、脂质和核酸等活性物质，提取枸杞子干果来源的细胞外囊泡的意义尤为重要。枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以促进巨噬细胞M1的极化作用，从而促进适应性免疫应答。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及应用，通过分离纯化制备得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡，制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以应用于促进诱导巨噬细胞M1的极化，从而促进适应性免疫应答。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1、将枸杞子干果于PBS缓冲液中浸泡，然后破壁研磨，得到枸杞子干果的研磨液；
[0008]S2、对S1中得到的枸杞子干果研磨液进行差速离心，离心得到的沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液；
[0009]S3、将S2中得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液加入蔗糖浓度梯度溶液的上层，然后进行离心，得到位于30～45％条带的蔗糖溶液，然后加入PBS缓冲液进行混合，混合均匀后二次离心，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。
[0010]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S1中所述枸杞子干果和PBS缓冲液的质量体积比为60g：120mL，所述PBS缓冲液的温度为4℃，所述浸泡的时间为8h。
[0011]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S2中所述差速离心包括以下步骤：
[0012]S201、将S1中得到的枸杞子干果研磨液在温度为4℃且离心力为2000g的条件下离心20min，取上清液得到第一离心液；
[0013]S202、将S201中得到的第一离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第二离心液；
[0014]S203、将S202中得到的第二离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第三离心液；
[0015]S204、将S203中得到的第三离心液在温度为4℃且离心力为10000g的条件下离心40min，取上清液得到第四离心液；
[0016]S205、将S204中得到的第四离心液在温度为4℃且离心力为100000g的条件下离心120min，得到沉淀。
[0017]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S205中所述离心时用到的离心管为超速离心管。
[0018]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S2中所述PBS缓冲液的体积为1mL且温度条件为4℃。
[0019]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述蔗糖浓度梯度溶液的浓度分别为60％、45％、30％和8％。
[0020]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述在蔗糖浓度梯度溶液中离心的条件为：在温度为4℃且离心力为150000g的条件下，在超速离心管中离心120min。
[0021]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述二次离心的条件为：在温度为4℃且离心力为100000g的条件下，在超速离心管中离心120min；
[0022]S3中所述用于混合的PBS缓冲液的体积为3mL且温度条件为4℃。
[0023]根据本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法：S3中所述枸杞子干果来源的细胞外囊泡于体积为500μL且温度条件为4℃的PBS缓冲液中重悬，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡悬液，于
‑
80℃的温度条件下冷冻保存。
[0024]本专利技术还提供一种上述枸杞子干果来源的细胞外囊泡的应用，所述枸杞子干果来源的细胞外囊泡通过诱导巨噬细胞M1极化而发挥适应性免疫应答。
[0025]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0026]本专利技术提供一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法及其应用，通过对枸杞子干果清洗然后进行PBS缓冲液浸泡、破壁机研磨、高速离心、超速离心、蔗糖梯度离心纯化和PBS缓冲液清洗去糖的步骤制备得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。本专利技术制备得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡可以应用于促进诱导巨噬细胞M1的极化，从而促进适应性免疫应答。
附图说明
[0027]图1是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法的流程图；
[0028]图2是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的TEM照片；
[0029]图3是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的NTA图；
[0030]图4是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的SDS
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PAGE蛋白表征图；
[0031]图5是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的INOS流式散点图；
[0032]图6是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的INOS流式差异性分析图；
[0033]图7是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的q
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PCR INOS差异性分析图；
[0034]图8是本专利技术提供的一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡促使巨噬细胞M1极化的IL
‑
6差异性分析图。
具体实施方式
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将枸杞子干果于PBS缓冲液中浸泡，然后破壁研磨，得到枸杞子干果研磨液；S2、对S1中得到的枸杞子干果研磨液进行差速离心，离心得到的沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液；S3、将S2中得到的枸杞子干果来源的细胞外囊泡重悬液加入蔗糖浓度梯度溶液的上层，然后进行离心，得到位于30～45％条带的蔗糖溶液，然后加入PBS缓冲液进行混合，混合均匀后二次离心，得到枸杞子干果来源的细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S1中所述枸杞子干果和PBS缓冲液的质量体积比为60g：120mL，所述PBS缓冲液的温度为4℃，所述浸泡的时间为8h。3.根据权利要求2所述的枸杞子干果来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，S2中所述差速离心包括以下步骤：S201、将S1中得到的枸杞子干果研磨液在温度为4℃且离心力为2000g的条件下离心20min，取上清液得到第一离心液；S202、将S201中得到的第一离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第二离心液；S203、将S202中得到的第二离心液在温度为4℃且离心力为4000g的条件下离心20min，取上清液得到第三离心液；S204、将S203中得到的第三离心液在温度为4℃且离心力为10000g的条件下离心40min，取上清液得到第四离心液；S205、将S204中得到的第四离心液在温度为4℃且离心力为100000g的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵嘉庆，高小平，周志超，辛云卓，宋东，温柔，尹梅，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：