一种高比活生淀粉水解酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高比活生淀粉水解酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用，本发明专利技术以稳定性欠佳的α

【技术实现步骤摘要】
一种高比活生淀粉水解酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高比活生淀粉水解酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用。

技术介绍

[0002]生淀粉水解酶指可以在淀粉的糊化温度以下直接降解生淀粉颗粒的酶。目前，在所有已发现的α
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淀粉酶中，具有降解生淀粉能力的α
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淀粉酶大约只有10％，分布于细菌、真菌和动物中。而这些α
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淀粉酶可水解马铃薯、小麦、玉米等的生淀粉。但是，比活力普遍较低。在已报道的生淀粉水解酶中，比酶活在4.9
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2370U/mg范围内。以玉米为底物时，来自Bacillus amyloliquefaciens的α
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淀粉酶的比酶活为44.6U/mg，来自Streptomyces badius DB
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1的α
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淀粉酶的比酶活为148.1U/mg，而来自Bacillus acidicola的α
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淀粉酶最高比酶活达874.5U/mg。这些具生淀粉水解能力的α
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淀粉酶因其偏低的酶活力限制了其在工业中的广泛应用。
[0003]在工业应用方面，淀粉加工工业普遍使用20
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30％(W/V)的淀粉浆为原料，目前以生淀粉水解酶直接作用高浓度生淀粉水解的研究较少。热稳定性也是淀粉加工中使用淀粉分解酶的重要特性，许多淀粉酶由于其稳定性较差导致在水解过程中无法持续发挥水解作用。因此利用蛋白质工程技术，获得比酶活较高且热稳定性较好的生淀粉水解酶对于水解高浓度玉米生淀粉的应用具有重要作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种高比活生淀粉水解酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用。本专利技术以稳定性欠佳的生淀粉水解酶Amy为基础，通过定点突变，获得了热稳定性有大幅度提高、且保留出发酶Amy比活力的突变酶Amy:ΔTG/W345A。以玉米生淀粉为底物时，突变体的比酶活为出发酶的85％，动力学参数测定结果表明，突变酶与出发酶接近。但其热稳定性大大提高，在35℃，pH7.0的条件下，是出发酶的20倍。在水解高浓度玉米生淀粉实验中，反应4h后，水解率可达到43％。该突变酶在水解高浓度玉米生淀粉为基础的工业应用中具有潜在价值。
[0005]本专利技术高比活生淀粉水解酶突变体，其氨基酸序列是如SEQ ID No：1所示的生淀粉水解酶的氨基酸序列中第181位的苏氨酸和第182位的甘氨酸被去除，且第345位的色氨酸被突变为丙氨酸。
[0006]本专利技术生淀粉水解酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
[0007]本专利技术生淀粉水解酶突变体的表达菌株，分类命名为Bacillus subtilis WB600/pBHSs142
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AmyZ1(ΔTG/W345A)，已送至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：CCTCC M 20221942，保藏时间为2022年12月12日，保藏地址：中国
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武汉
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武汉大学。
[0008]本专利技术生淀粉水解酶突变体表达菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0009]首先以来自Bacillus licheniformis的α
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淀粉酶BLA结构为模板，利用Swiss
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Model对生淀粉水解酶Amy的结构进行同源建模。采用半理性设计策略，将Amy与BLA的序列与结构进行比对，分析确定突变的目标氨基酸。
[0010]根据生淀粉水解酶Amy的基因序列，设计并合成突变引物，以含有生淀粉水解酶Amy基因的重组质粒为模板，以上述的合成突变引物为引物，基于重叠延伸PCR的方法进行定点突变，获得了热稳定性有大幅度提高的生淀粉水解酶的突变基因。
[0011]在E.coli BL21(DE3)中构建的未突变的生淀粉水解酶质粒为模板，采用重叠延伸PCR的方式构建突变基因；再通过POE
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PCR的方法，将突变基因与载体pBHSs142进行连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌WB600，筛选阳性克隆，得到含有本专利技术突变基因的工程菌株。
[0012]上述构建方法中所述表达质粒载体包括pET22b、pBHSs142等。
[0013]上述构建方法中所述宿主菌包括E.coli BL21(DE3)和WB600等。
[0014]本专利技术生淀粉水解酶突变体可由所述表达菌株发酵获得。
[0015]本专利技术生淀粉水解酶突变体的应用，是将所述生淀粉水解酶突变体应用于水解高浓度玉米生淀粉(浓度20
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30％，W/V)。以玉米生淀粉为底物时，在35℃，pH7.0条件下，突变酶的比酶活为野生型的85％。动力学参数测定结果表明突变体对玉米生淀粉的催化效率相较于出发酶差别不大。在保持比酶活的同时，突变酶的稳定性有大幅度的提升。在30℃和35℃条件下，热稳定性是出发酶的15倍和20倍。在水解高浓度玉米生淀粉实验中，反应4h后，水解率可达到43％。该突变体在水解高浓度玉米生淀粉为基础的工业应用中具有潜在价值。
[0016]本专利技术对突变体蛋白和原始野生型蛋白的比酶活、最适温度、最适pH、动力学参数、稳定性等进行了测定和比较。测定结果显示，以玉米生淀粉为底物时，本专利技术在接近比酶活的同时，在30℃和35℃条件下，稳定性较出发酶有大幅度提升。
附图说明
[0017]图1、2为本专利技术PCR扩增产物的电泳图谱：图1中各泳道分别为DNAmarker、PCR扩增的片段；图2中各泳道分别为DNAmarker、PCR扩增的载体。
[0018]图3为纯化的突变蛋白和出发酶Amy的SDS
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PAGE图谱：1为出发酶Amy粗酶，2为出发酶Amy纯酶，3为Amy:ΔTG/W345A粗酶，4为Amy:ΔTG/W345A纯酶，M为蛋白marker。
[0019]图4中a为最适温度测定结果，b为最适pH测定结果。
[0020]图5中a为30℃、pH7.0条件下的稳定性，b为35℃、pH7.0条件下的稳定性。
具体实施方式
[0021]下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0022](一)含有本专利技术生淀粉水解酶突变基因的表达菌株的构建
[0023]1、生淀粉水解酶基因突变位点的选择
[0024]基于序列比对，生淀粉水解酶Amy与来自Bacillus licheniformis的α
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淀粉酶BLA氨基酸序列一致性为71％。以BLA的结构作为模板，利用Swiss
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Model对生淀粉水解酶Amy的
结构进行同源建模。
[0025]根据模拟结构及多序列比对，确定定点突变的位点为181位点的苏氨酸T和182位点的甘氨酸以及345位点的色氨酸W，突变方向为去除181位点的苏氨酸T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高比活生淀粉水解酶突变体，其特征在于：所述高比活生淀粉水解酶突变体的氨基酸序列是如SEQ ID No：1所示的生淀粉水解酶的氨基酸序列中第181位的苏氨酸和第182位的甘氨酸被去除，且第345位的色氨酸被突变为丙氨酸。2.权利要求1所述生淀粉水解酶突变体的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。3.权利要求1所述生淀粉水解酶突变体的表达菌株，其特征在于：所述表达菌株的分类命名为BacillussubtilisWB600/pBHSs142
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AmyZ1(ΔTG/W345A...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖亚中，何玉，房伟，张学成，方泽民，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：