中温淀粉酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程与蛋白质改造技术领域，具体提供了中温淀粉酶突变体及其应用。本发明专利技术以野生型中温淀粉酶ZD5为基础，提供了包含N455A、D487K或G573V单个突变位点的突变体。与野生型相比，本发明专利技术提供的淀粉酶单点突变体的比活力普遍提高了87.8%

【技术实现步骤摘要】
中温淀粉酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质改造
，具体涉及一种中温淀粉酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]淀粉酶（Amyalase, E.C.3.2.1.1），是可对支链淀粉、直链淀粉或其他葡聚糖分子内部糖苷键以随机的方式进行水解，生成长度不等的直链和支链寡糖的一类酶的总称。其中，中温α
‑
淀粉酶是一类最适反应温度在50～70℃的α
‑
淀粉酶，也是目前应用最为广泛的淀粉酶，其广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、饲料、轻化工业、食品、造纸、医药、石油开采等各个领域。α
‑
淀粉酶全称为α
‑
1,4
‑
葡聚糖水解酶（EC3.2.1.1），作用于淀粉时，可从分子内部切开α
‑
1,4
‑
糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α
‑
构型，故得名为α
‑
淀粉酶。α
‑
淀粉酶是最重要的一类酶，也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。据统计，淀粉酶占酶制剂市场约25%的份额，是非常重要的工业用酶。中温α
‑
淀粉酶作为食品添加剂、饲料添加剂或者辅助添加剂添加到食品、饲料、药品和日化产品中，具有广泛的应用价值。
[0003]淀粉是谷物类饲料碳水化合物的主要成分，也是畜禽所需能量的重要能源。幼龄动物由于消化系统发育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。有研究报道，在饲粮中添加外源α
‑
淀粉酶可以补充动物内源酶的不足，帮助幼龄动物消化利用淀粉，其生长性能与饲料转化率十分有益。肉鸡日粮中添加产α
‑
淀粉酶的活大肠杆菌培养物可以起到抗生素生长促进剂的作用，改善肠道形态，提高生产性能。目前在饲料生产中α
‑
淀粉酶主要和纤维素酶、蛋白酶、植酸酶等酶类混合使用添加到饲料当中，在畜禽的肠道内发挥作用，分解饲料中的淀粉类物质，促进消化，提高利用率。
[0004]中温淀粉酶的研制和开发，对于尽快实现国产化生产，满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等具有十分重要的意义。但是现有的中温淀粉酶的酶活和产量都难以令人满意，因此急需研发出酶活高、产量高、生产成本低且使用pH较宽泛的中温α
‑
淀粉酶，以满足日益增长的工业化生产需求。中温α
‑
淀粉酶早期的研究工作主要是产酶微生物菌株的选育，发酵条件优化、酶的纯化和理化性质、酶水解作用机理等方面。随着基因和蛋白质工程技术的广泛应用，中温α
‑
淀粉酶的研究开始转向基因的克隆表达和活性位点等方面的研究，以满足饲料工业发展的需求。
[0005]
技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种中温淀粉酶突变体及其应用。所述突变体的比活力显著高于野生型，可广泛应用于饲料、食品加工等领域。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术一方面提供了一种淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0008]本专利技术一方面提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的淀粉酶的第455位氨基酸由Asn变为Ala。
[0009]本专利技术还提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的淀粉酶的第487位氨基酸由Asp变为Lys。
[0010]本专利技术还提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的淀粉酶的第573位氨基酸由Gly变为Val。
[0011]本专利技术还涉及编码上述淀粉酶突变体的DNA分子。
[0012]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0013]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0014]所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0015]将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的淀粉酶突变体的比活力得到显著提升。
[0016]本专利技术还提供了上述淀粉酶突变体在饲料生产或食品加工领域中的应用。
[0017]本专利技术以野生型中温淀粉酶ZD5为基础，提供了包含N455A、D487K或G573V单个突变位点的突变体。与野生型相比，本专利技术提供的淀粉酶单点突变体的比活力普遍提高了87.8%
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146.7%；其中，含N455A单点突变的突变体ZD5
‑
1，其比活力最高，取得了意料不到的技术效果。
[0018]本专利技术提供的N455A、D487K和G573V三个突变位点能显著提高中温淀粉酶ZD5的比活力，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。
具体实施方式
[0019]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。例如，本专利技术可选用如下实验材料和试剂：实验试剂：DNA聚合酶购自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒和胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0020]菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。
[0021]培养基：LB培养基（大肠杆菌培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；YPD培养基（酵母培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；MD培养基（酵母筛选培养基）：1.34% YNB，4
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‑5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，
5 μl、Not I 5 μl、ddH2O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
[0032]将双酶切后的中温淀粉酶基因片段分别与表达载体pPIC9K连接，连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、中温淀粉酶基因双酶切产物3 μl、10
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T
4 ligase 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淀粉酶，其特征在于，所述淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。2.一种淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的淀粉酶的第455位氨基酸由Asn变为Ala。3.一种淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的淀粉酶的第487位氨基酸由Asp变为Lys。4.一种淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的淀粉酶的第573位氨基酸由Gly变为Val。5.编码权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静静，鲍锴，程斯达，康丽华，刘文瑶，葛菁华，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：