烟粉虱唾液钙网蛋白基因、其特异性dsRNA及应用制造技术

本发明专利技术属于生物防治技术领域，尤其涉及一种烟粉虱唾液钙网蛋白基因、其特异性dsRNA及应用。所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术研究发现烟粉虱唾液钙网蛋白(BtCRT)能够结合植物中的钙离子，从而使韧皮部保持畅通并促进昆虫从筛管中持续取食，以BtCRT基因为靶标，基于RNAi技术，采用靶向BtCRT基因的dsRNA抑制或沉默该基因后，能够有效抑制烟粉虱成虫的取食，显著增加烟粉虱成虫的死亡率，并降低蜜露分泌量，实现防治作用。本发明专利技术提供的BtCRT基因及其特异性的dsRNA在生物防治烟粉虱领域具有重要的应用价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
烟粉虱唾液钙网蛋白基因、其特异性dsRNA及应用


[0001]本专利技术涉及生物防治
，特别涉及一种烟粉虱唾液钙网蛋白基因、其特异性dsRNA及应用。

技术介绍

[0002]烟粉虱(Bemisia tabaci(Gennadius))属半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，是一种世界性的重大农业害虫，其分布范围广，广泛分布于热带、亚热带及低纬度温带地区，且寄主植物多，主要危害十字花科、茄科、葫芦科、豆科、菊科、锦葵科等植物，是棉花、番茄、烟草等许多经济作物的重要害虫。烟粉虱的危害包括直接取食植物韧皮部汁液使得植物萎蔫，分泌蜜露形成霉污病从而阻抑光合作用以及传播多种植物病毒导致作物病毒病流行。烟粉虱从上世界90年代中后期开始入侵我国，近年来已在二十多个省份暴发成灾，每年造成的损失高达数十亿元。随着烟粉虱及其传播的病毒在全国各地的迅速扩张，它们已经成为我国农业生产上非常难治理的一类虫害，给我国农业生产带来了巨大的经济损失。
[0003]烟粉虱的田间防治主要依赖化学防治。通过使用化学杀虫剂降低田间虫口数量，间接地降低烟粉虱传播病毒病的危害。然而，化学杀虫剂的大量使用不仅危害农村生态环境和人民的食品安全，还导致烟粉虱杀虫剂抗性水平增加。此外，由于烟粉虱还具有世代重叠、繁殖速度快的特点，故而传统的杀虫剂对烟粉虱的防控效果并不理想。因此，新型烟粉虱防控技术的开发十分必要。
[0004]利用RNAi防治害虫是一种新兴的害虫防治策略。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性的双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶细胞表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。近些年，RNAi技术在昆虫研究上得到越来越多的应用，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力丧失，从而达到利用或防治其危害的目的，具有对环境友好、杀虫专一性强、对非靶标生物无害等优点，为农作物的害虫防治提供了新的策略。
[0005]在植物与烟粉虱长期的协同进化过程中，植物建立起一套精密而又复杂的防御体系以应对烟粉虱取食。同时，烟粉虱为应对植物防御反应也进化出强大的反防御能力，烟粉虱在取食植物的时候会分泌大量唾液，这些唾液中的蛋白能够调控植物防御反应，帮助烟粉虱顺利取食。深入研究影响烟粉虱取食及其与植物互作的关键基因，以该基因作为靶标基因进行干扰对于烟粉虱的防治具有重要意义。然而，目前尚不清楚烟粉虱取食寄主植物的分子机制，对烟粉虱的功能基因研究也相对较少，针对于烟粉虱的有效靶标基因还未见报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种烟粉虱唾液钙网蛋白基因，并提供了靶向该烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA，以及烟粉虱唾液钙网蛋白基因
和特异性dsRNA在防控烟粉虱中的应用，以解决或至少缓解现有技术中的部分问题。
[0007]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种烟粉虱唾液钙网蛋白基因，所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术的第二方面提供了如上所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因作为靶点在筛选或制备防治烟粉虱的药物中的应用。
[0010]本专利技术的第三方面提供了一种烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA，所述特异性dsRNA由两条互补的序列组成，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]进一步地，所述特异性dsRNA的制备方法包括：以如上所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因或者烟粉虱总cDNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物进行扩增，得到含有T7启动子的基因片段，以前述的基因片段作为模板，进行逆转录，之后纯化，得到靶向所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因的所述特异性dsRNA。
[0012]进一步地，所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因通过基因合成或者PCR扩增得到。
[0013]更进一步地，所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因的制备方法包括：提取烟粉虱总RNA，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物进行逆转录，获得所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因的cDNA全长。
[0014]本专利技术第四方面提供了如上所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA在防治烟粉虱中的应用。
[0015]进一步地，防治烟粉虱包括降低烟粉虱蜜露分泌量、提高烟粉虱死亡率和/或抑制烟粉虱唾液钙网蛋白基因的表达。
[0016]本专利技术第五方面提供了一种防治烟粉虱的药物，其活性成分为如下A
‑
C中的任一种或多种：
[0017]A、如上所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA；
[0018]B、编码A中所述特异性dsRNA的DNA分子；
[0019]C、包含B中所述DNA分子的表达载体或宿主细胞。
[0020]本专利技术第六方面提供了一种防治烟粉虱的方法，包括以下步骤：将如上所述的防治烟粉虱的药物导入烟粉虱内。
[0021]本专利技术的优点及积极效果为：
[0022]本专利技术研究发现烟粉虱的唾液钙网蛋白(BtCRT)能够结合植物中的钙离子，从而使韧皮部保持畅通并促进昆虫从筛管中持续取食，以BtCRT基因为靶标，基于RNAi技术，采用靶向BtCRT基因的dsRNA抑制或沉默该基因后，能够有效抑制烟粉虱成虫的取食，显著增加烟粉虱成虫的死亡率，并降低蜜露分泌量，实现防治作用。本专利技术提供的BtCRT基因及其特异性的dsRNA在生物防治烟粉虱领域具有重要的应用价值。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于
本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为本专利技术实施例3的烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA饲喂装置和饲喂流程图；
[0025]图2为本专利技术实施例3饲喂含有烟粉虱唾液钙网蛋白基因的dsRNA或GFP基因的dsRNA或未饲喂任何溶液的烟粉虱成虫在烟草上取食7天后唾液腺中BtCRT基因的相对表达量图，其中，不同小写字母表示差异性显著；
[0026]图3为本专利技术实施例3饲喂含有烟粉虱唾液钙网蛋白基因的dsRNA或GFP基因的dsRNA或未饲喂任何溶液的烟粉虱成虫在烟草上取食7天后蜜露分泌量比较图，其中，不同小写字母表示差异性显著；
[0027]图4为本专利技术实施例3饲喂含有烟粉虱唾液钙网蛋白基因的dsRNA或GFP基因的dsRNA或未饲喂任何溶液的烟粉虱成虫在烟草上取食7天后死亡率比较图，其中，不同小写字母表示差异性显著。
具体实施方式...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟粉虱唾液钙网蛋白基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因作为靶点在筛选或制备防治烟粉虱的药物中的应用。3.一种烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA，其特征在于，所述特异性dsRNA靶向如权利要求1所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因，所述特异性dsRNA由两条互补的序列组成，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求3所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA，其特征在于，所述特异性dsRNA的制备方法包括：以如权利要求1所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因或者烟粉虱总cDNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物进行扩增，得到含有T7启动子的基因片段，以前述的基因片段作为模板，进行逆转录，之后纯化，得到靶向所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因的所述特异性dsRNA。5.根据权利要求4所述的烟粉虱唾液钙网蛋白基因的特异性dsRNA，其特征在于，所述烟粉虱唾液钙网蛋白基因通过基因合成或者PCR扩增得到。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏奇，吴青君，童虹，杨冯波，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：