基因测序合成反应试剂、测序方法技术

本发明专利技术公开了一种基因测序合成反应试剂、测序方法。所述合成反应试剂中含有阿魏酸、没食子酸乙酯和甘油。本发明专利技术在常规基因测序合成反应试剂中添加一定浓度的阿魏酸、没食子酸乙酯和甘油，优化后的合成反应试剂能够防止试剂变色和沉淀的问题，提高产品的稳定性，使得试剂长期保存不变色，延长产品的效期。同时，该合成反应试剂又可以在取消拍照试剂，减少试剂种类的基础上保护DNA，避免激光对DNA的损伤。将该合成反应试剂用于基因测序的聚合反应，可以使聚合反应和信号采集步骤同时进行，在保证缩短测序循环时间的基础上有效的减缓测序中荧光信号的淬灭，提升整体的测序质量。提升整体的测序质量。

【技术实现步骤摘要】
基因测序合成反应试剂、测序方法


[0001]本专利技术属于基因测序领域，特别是涉及一种优化的二代基因测序合成反应试剂、测序方法。

技术介绍

[0002]当前的二代测序(sequencing by synthesis,SBS)有两大代表技术，分别是Illumina公司的桥式扩增技术和华大基因的DNBSEQ技术，两大技术的共同点是通过检测荧光信号的方式来鉴定和区分DNA序列中的四种不同的碱基(A、C、G和T/U)。两大技术都使用了带有四种不同荧光标记的dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，这四种dNTP带有相同的阻断基团。基于二代测序技术，当前的测序方法主要包括三个步骤：1、聚合反应：在聚合酶的作用下带有荧光标记和阻断基团的dNTPs被添加到测序合成链的3
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端；2、信号采集：发生在聚合反应结束之后，测序仪内含的光学系统将会通过激光对荧光信号进行拍照和采集；3、切除反应：信号采集结束后，通过泵入切除试剂将dNTPs上包含的荧光基团和阻断基团切除掉，以便dNTPs在天然的状态下进入下一轮测序循环。
[0003]近些年二代测序技术迅猛发展，但是目前还是会有多方面的限制，例如相关试剂的性质、测序仪的光学采集系统等等，这些限制导致当前的二代测序方法只能按照上述步骤依次进行。如果将测序中的聚合反应与信号采集步骤同步进行，不仅可以缩短测序循环的时间，还可以减少测序试剂盒中试剂的种类，降低测序成本。但在信号采集过程中，因为缺乏成像缓冲液的保护，荧光信号淬灭的很快，而且整体的测序质量也有较大幅度的下降。
[0004]本专利技术的研发团队在前期工作中优化了一种测序合成试剂，实现了将聚合反应和信号采集同时进行，有效地缩短了测序过程中的反应时间，这种试剂能够有效的减缓合成和信号采集同时进行时产生的荧光信号的淬灭，保护DNA链不受激光损伤，提高整体的测序质量。但是，后续的实验过程中发现这种试剂在长期存储的过程中出现了变色和沉淀的问题，不能保证试剂准确的效期，影响测序质量。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术提供了一种合成反应试剂，该合成反应试剂可以解决变色和沉淀的问题，提高产品的稳定性，延长产品的效期，同时可以保护DNA链不受激光损伤，减缓合成和信号采集同时进行时产生的荧光信号的淬灭，提高整体的测序质量。
[0006]本专利技术包括如下技术方案。
[0007]一种合成反应试剂，所述合成反应试剂中含有阿魏酸、没食子酸乙酯和甘油。
[0008]在其中一些实施例中，阿魏酸在所述合成反应试剂中的浓度为0.5mM～1.5mM。
[0009]在其中一些实施例中，没食子酸乙酯在所述合成反应试剂中的浓度为1.5mM～2.5mM。
[0010]在其中一些实施例中，甘油在所述合成反应试剂中的质量浓度为0.5～5％。
[0011]在其中一些实施例中，阿魏酸在所述合成反应试剂中的浓度为0.8mM～1.2mM，没
食子酸乙酯在所述合成反应试剂中的浓度为1.8mM～2.2mM，甘油在所述合成反应试剂中的质量浓度为1.8～2.2％。
[0012]在其中一些实施例中，所述合成反应试剂中还包括缓冲液、可溶性盐、聚合酶和核苷酸类似物。
[0013]在其中一些实施例中，所述缓冲液选自HEPES(4
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羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、SSC(柠檬酸钠)缓冲液、Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)缓冲液和PBS(磷酸盐)缓冲液中的至少一种。
[0014]在其中一些实施例中，所述缓冲液中的缓冲剂的浓度为0.1mM～1000mM。
[0015]在其中一些实施例中，所述可溶性盐选自铵盐、镁盐和钠盐中的至少一种。
[0016]在其中一些实施例中，所述铵盐为硫酸铵和/或氯化铵。
[0017]在其中一些实施例中，所述镁盐为硫酸镁和/或氯化镁。
[0018]在其中一些实施例中，所述钠盐为氯化钠和/或EDTA(乙二胺四乙酸)。
[0019]在其中一些实施例中，所述铵盐在所述合成反应试剂中的终浓度为1mM～50mM。
[0020]在其中一些实施例中，所述铵盐为5mM～20mM的硫酸铵。
[0021]在其中一些实施例中，所述镁盐在所述合成反应试剂中的终浓度为1mM～20mM。
[0022]在其中一些实施例中，所述镁盐为1mM～5mM的硫酸镁。
[0023]在其中一些实施例中，所述钠盐为氯化钠和EDTA，所述氯化钠在所述合成反应试剂中的终浓度为1mM～100mM，所述EDTA在所述合成反应试剂中的终浓度为0.1mM～10mM。
[0024]在其中一些实施例中，所述核苷酸类似物为修饰有荧光基团和/或阻断基团的脱氧核苷酸。
[0025]在其中一些实施例中，所述核苷酸类似物为修饰有荧光基团和阻断基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，所述dATP、dCTP、dGTP和dTTP各自在所述合成反应试剂中的终浓度分别为0.1uM～10uM。
[0026]在其中一些实施例中，所述聚合酶为聚合酶9N或聚合酶Slim。
[0027]在其中一些实施例中，所述聚合酶在所述合成反应试剂中的终浓度为0.001mg/mL～0.1mg/mL。
[0028]在其中一些实施例中，所述合成反应试剂由HEPES缓冲液、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4、EDTA、聚合酶Slim、核苷酸类似物、阿魏酸、没食子酸乙酯和甘油组成；
[0029]所述核苷酸类似物为修饰有荧光基团和阻断基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
[0030]在其中一些实施例中，所述合成反应试剂由如下浓度的组分组成：45～55mM HEPES缓冲液、45mM～55mM NaCl、5mM～15mM(NH4)2SO4、2mM～4mM MgSO4、0.8mM～1.2mM EDTA、0.015mg/mL～0.025mg/mL聚合酶Slim、修饰有荧光基团和阻断基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1uM～1.2uM、0.8mM～1.2mM阿魏酸、1.8mM～2.2mM没食子酸乙酯、和1.8～2.2％甘油。
[0031]本专利技术还提供了一种测序方法，包括如下技术方案。
[0032]一种测序方法，包括以下步骤：
[0033]聚合反应：待测核酸分子与所述合成反应试剂反应；
[0034]信号采集：激发荧光基团产生荧光信号，识别荧光信号得到碱基类型和位置；
[0035]切除反应：切除阻断基团和荧光基团；
[0036]重复聚合反应
‑
信号采集
‑
切除反应的循环。
[0037]在其中一些实施例中，聚合反应开始0～60s后随即开始信号采集。
[0038]在其中一些实施例中，聚合反应的温度为45～70℃。
[0039]在其中一些实施例中，信号采集的反应温度为35～70℃。
[0040]在其中一些实施例中，切除反应的反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成反应试剂，其特征在于，所述合成反应试剂中含有阿魏酸、没食子酸乙酯和甘油。2.根据权利要求1所述的合成反应试剂，其特征在于，阿魏酸在所述合成反应试剂中的浓度为0.5mM～1.5mM。3.根据权利要求1所述的合成反应试剂，其特征在于，没食子酸乙酯在所述合成反应试剂中的浓度为1.5mM～2.5mM。4.根据权利要求1所述的合成反应试剂，其特征在于，甘油在所述合成反应试剂中的质量浓度为0.5～5％。5.根据权利要求1所述的合成反应试剂，其特征在于，阿魏酸在所述合成反应试剂中的浓度为0.8mM～1.2mM，没食子酸乙酯在所述合成反应试剂中的浓度为1.8mM～2.2mM，甘油在所述合成反应试剂中的质量浓度为1.8～2.2％。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的合成反应试剂，其特征在于，所述合成反应试剂中还包括缓冲液、可溶性盐、聚合酶和核苷酸类似物。7.根据权利要求6所述的合成反应试剂，其特征在于，所述缓冲液选自HEPES缓冲液、SSC缓冲液和PBS缓冲液中的至少一种；和/或，所述可溶性盐选自铵盐、镁盐和钠盐中的至少一种；和/或，所述核苷酸类似物为修饰有荧光基团和/或阻断基团的脱氧核苷酸；和/或，所述聚合酶为聚合酶9N或聚合酶Slim。8.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：何淑红，张长领，王谷丰，刘二凯，赵陆洋，
申请(专利权)人：深圳赛陆医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：