一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒技术

本申请提出一种小分子

【技术实现步骤摘要】
一种小分子
‑
DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒


[0001]本申请涉及图谱测序
，尤其涉及一种小分子
‑
DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒。

技术介绍

[0002]与染色质DNA相互作用的小分子化合物具有重要的抗肿瘤潜力，许多染色质DNA互作分子已经作为药物在临床上广泛应用，例如Etoposide和Romidepsin (Nat Rev Genet 2014, 15, 783
‑
796.)。随着基因组结构和功能的研究越来越深入，通过小分子靶向染色质DNA或与DNA结合的相关蛋白来干预生物过程和疾病状态的策略具有广阔的发展前景。为此，在基因组水平检测小分子化合物的DNA靶标至关重要，因为小分子与染色质DNA结合位点图谱有助于解释下游的遗传学或表观遗传学机制。
[0003]蛋白质与DNA的结合位点，可以通过染色质免疫沉淀测序（ChIP
‑
seq）、靶点剪切与标签化（CUT&Tag）等成熟的方法检测。然而，小分子与DNA结合位点的检测则面临巨大挑战。关键难点是，小分子
‑
DNA相互作用的解离速率常数通常较大，导致小分子在洗涤步骤中会从DNA靶点脱离。已有的几种类似ChIP
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seq和CUT&Tag的小分子
‑
DNA互作位点分析方法都无法高效富集靶点DNA片段，只适用于高亲和力、低解离速率的小分子，并且具有背景高、信号弱、所需细胞量大等问题。因此，许多已在临床广泛应用的靶向细胞DNA的小分子药物的具体基因组靶点无法明确，制约了药物作用机制的研究和新药研发。快速、高效检测各种小分子与染色质DNA结合位点图谱，是该领域的迫切需求。
[0004]经典的Chem
‑
seq方法的流程如下：首先，对小分子化合物进行生物素化修饰。其次，在活细胞或者体外甲醛交联后的细胞内，加入生物素修饰的小分子进行孵育。然后，用超声波打断染色质，使小分子化合物与小片段DNA的复合体游离至溶液中。下一步，在溶液中加入表面修饰了链霉亲和素的磁珠进行孵育，捕获目标小分子化合物及其所结合的DNA片段。接着，纯化洗脱捕获下来的DNA片段。最后，制备DNA文库并进行二代测序。其中该方法耗时长，步骤复杂，同时Chem
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seq方法与相关技术（Click chemistry enables preclinical evaluation of targeted epigenetic therapies. Science 2017, 356 (6345), 1397
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1401）中记载的Click
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seq方法信噪比低、所需细胞量大、重现性差。近期文献报道的Chem
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map方法为：首先，对小分子化合物进行生物素化修饰。其次，在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入生物素修饰的小分子进行孵育。然后依次结合生物素抗体、二抗以及pA/G
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Tn5转座酶；然后在加入镁离子激活Tn5酶活性后，对小分子结合位点的DNA进行剪切，同时连接测序接头。DNA片段经过PCR扩增后，进行二代测序，其整体步骤和CUT&Tag基本一致，但该所需细胞量仍然要10万个细胞左右，且只适用于结合力强的小分子。

技术实现思路

[0005]本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的目的在于提出一种小分子
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DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒，各种小分子的染色质
DNA结合图谱都可以通过本方法进行检测，适用性广；且成本更低，步骤更简单，文库制备时间最快只需3小时。
[0006]根据本申请的第一个方面提出了一种小分子
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DNA相互作用图谱测序方法，包括以下步骤：(1)利用叠氮基团修饰后的小分子化合物和生物素同时修饰在转座酶的接头序列的5位形成第一接头；所述第一接头连接在所述转座酶的剪切活性靶标位点完成所述小分子化合物与所述生物素偶联修饰的转座酶A的构建；(2)在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入含有所述转座酶A和镁离子的溶液进行孵育，以使小分子化合物结合位点被切割，同时生物素修饰的所述第一接头连接在DNA的特定位点；(3)洗脱游离的所述转座酶A后加入含有转座酶B和镁离子的溶液继续孵育，以切割所述细胞的染色质开放性区域的DNA片段；其中所述转座酶B为在所述转座酶的剪切活性靶标位点连接第二接头形成；(4)富集切割的DNA片段并进行PCR扩增和二代测序，完成染色质DNA结合图谱测序文库的构建。
[0007]在一些实施例中，步骤(1)中，利用叠氮基团修饰所述小分子化合物的方法为：通过所述小分子化合物的侧链官能团与叠氮基团连接，并使得所述叠氮基团与所述小分子化合物的骨架之间保持设定距离。
[0008]在一些实施例中，所述叠氮基团与所述小分子化合物之间设置至少一个连接基团，用以保持两者之间的设定距离。
[0009]在一些实施例中，所述小分子化合物能够与染色质DNA相互作用，且其侧链官能团包括氨基、羟基、或羧基。
[0010]在一些实施例中，所述转座酶能特异性结合双链序列；所述转座酶包括Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10转座酶。
[0011]在一些实施例中，步骤(1)中，所述第一接头由等摩尔的DBMEA寡核苷酸和ME寡核苷酸退火杂交形成；所述DBMEA寡核苷酸通过所述叠氮基团修饰后的所述小分子化合物与DBCO
‑
BMEA寡核苷酸经过点击化学反应得到；所述DBCO
‑
BMEA寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示；所述ME寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示；5
’‑
DBCO
‑
Biotin dT
‑
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
‑3’
；SEQ ID NO.1；其中该序列中5
’
端DBCO修饰，第一个T碱基侧链生物素修饰；5
’‑
P
‑
CTGTCTCTTATACACATCT
‑
NH2‑3’
；SEQ ID NO.2；该序列中5
’
端磷酸化，3
’
端氨基修饰。
[0012]在一些实施例中，所述第二接头的序列如SEQ ID NO.3所示；MEB寡核苷酸：5
’‑
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
‑3’
；SEQ ID NO.3。
[0013]在一些实施例中，步骤(2)中包括步骤：i)利用活化的刀豆蛋白A磁珠捕获细胞，使得细胞附着在所述刀豆蛋白A磁珠上；ii)加入含有洋地黄皂苷、牛血清蛋白的溶液孵育细胞用于通透所述细胞并封闭所述细胞中非本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小分子
‑
DNA相互作用图谱测序方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用叠氮基团修饰后的小分子化合物和生物素同时修饰在转座酶的接头序列的5位形成第一接头；所述第一接头连接在所述转座酶的剪切活性靶标位点完成所述小分子化合物与所述生物素偶联修饰的转座酶A的构建；(2)在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入含有所述转座酶A和镁离子的溶液进行孵育，以使小分子化合物结合位点被切割，同时生物素修饰的所述第一接头连接在DNA的特定位点；(3)洗脱游离的所述转座酶A后加入含有转座酶B和镁离子的溶液继续孵育，以切割所述细胞的染色质开放性区域的DNA片段；其中所述转座酶B为在所述转座酶的剪切活性靶标位点连接第二接头形成；(4)富集切割的DNA片段并进行PCR扩增和二代测序，完成染色质DNA结合图谱测序文库的构建。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用叠氮基团修饰所述小分子化合物的方法为：通过所述小分子化合物的侧链官能团与叠氮基团连接，并使得所述叠氮基团与所述小分子化合物的骨架之间保持设定距离。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述叠氮基团与所述小分子化合物之间设置至少一个连接基团，用以保持两者之间的设定距离。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物能够与染色质DNA相互作用，且其侧链官能团包括氨基、羟基、或羧基。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座酶能特异性结合双链序列，所述转座酶包括Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10转座酶。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一接头由等摩尔的DBMEA寡核苷酸和ME寡核苷酸退火杂交形成；所述DBMEA寡核苷酸通过所述叠氮基团修饰后的所述小分子化合物与DBCO
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BMEA寡核苷酸经过点击化学反应得到；所述DBCO
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BMEA寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示；所述ME...

【专利技术属性】
技术研发人员：李景虹，滕续聪，戴依聪，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：