一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种在全基因组水平鉴定植物R

【技术实现步骤摘要】
一种在全基因组水平鉴定植物R
‑
loop位点的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种在生理状态下，在全基因组水平鉴定植物R
‑
loop位点的方法。

技术介绍

[0002]真核生物基因组中，除了典型的右手DNA双螺旋结构(又称为B型DNA)外，还存在一些非B型DNA的特殊二级结构，例如R
‑
loop、G四联体(G4)和i
‑
motif等结构。其中，R
‑
loop是指基因组中，一条RNA链与其互补的DNA形成DNA
‑
RNA杂合链，同时把另一条互补的DNA转换成单链状态，形成了一种类似于R字形的三链核酸结构，被称为R
‑
loop结构。R
‑
loop三链结构中，DNA
‑
RNA杂合链的热稳定性远大于双链DNA或RNA(Roberts RW et al.,1992,Science,258(5087):1463
‑
1466)。R
‑
loop结构广泛分布于细菌、真菌、哺乳动物(如小鼠)、人类基因组以及高等植物(如拟南芥，水稻等)中。R
‑
loop结构具有一系列的生物学功能。例如，导致人体基因组的不稳定、增加人类癌症风险、导致DNA双链断裂、影响基因转录、调控植物开花及根系的发育等。因此，人和动物植物基因组中，R
‑
loop的鉴定及生物学功能研究已成为的一个新的研究热点。
[0003]目前在全基因组水平上捕获R
‑
loop的方法主要有：基于S9.6抗体的DRIP
‑
seq(DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)(Fang Y et al.,2019,Genome Research,29(8):1287
‑
1297)和ssDRIP
‑
seq(single
‑
strand DNAligation
‑
based library construction of DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)(Xu W et al.,2017,Nature Plants,3(9):704
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714)以及基于核糖核酸酶H(RNaseH)的MapR(a Native and Antibody
‑
Independent R
‑
Loop Detection Strategy)(Qingqing Yan et al.,2019,Cell Rep,29(5):1369
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1380)和R
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ChIP(expressing a catalytically dead RNASEH1 followed by strand
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specific amplification of immunoprecipitated(IPed)DNA)(Chen L et al.,2017,Molecular Cell,68(4):745
‑
757)等。DRIP
‑
seq和ssDRIP
‑
seq鉴定R
‑
loop的主要原理如下：首先使用S9.6抗体特异性地识别并富集DNA:RNA杂交链后，ssDRIP
‑
seq采用单链DNA建库方法进行测序文库构建，而DRIP
‑
seq先用核糖核酸酶H(RNaseH)消化结构中与DNA杂合的RNA链，最后合成杂合链DNA的第二链。在合成双链DNA过程中，胸腺嘧啶(T)碱基会被脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)替换，然后新的含有尿嘧啶(U)的DNA链会被尿嘧啶糖基化酶消化掉，最后构建成链特异的测序文库。通过Illumina测序平台测序，获得原始测序数据，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定R
‑
loop位点。理论上，DRIP能够特异性地识别基因组中RNase H敏感的R
‑
loop，因此该方法通常采用RNase H预处理相同样本作为阴性对照。而MapR和R
‑
ChIP是利用缺陷型RNaseH(只具有识别但不具有切割DNA
‑
RNA杂合链的功能)特别性地识别并结合染色质上的R
‑
loop结构，其中，MapR利用缺陷型RNaseH与微球菌核酸酶(MNase酶)的融合蛋白通过识别并切割R
‑
loop附近的DNA片段，从而释放并捕获R
‑
loop结构，用于建库测序，而R
‑
ChIP则利用细胞系瞬时表达缺陷型RNaseH与一种Tag如GFP的融合蛋白，通过基于Tag的抗体来特异性的富集DNA
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RNA杂合链，
用于建库测序。经生物信息学分析，两种方法均可以在全基因组水平鉴定R
‑
loop位点。
[0004]目前，植物中主要利用ssDRIP
‑
seq和DRIP
‑
seq的方法鉴定R
‑
loop结构，该方法主要依赖单克隆S9.6抗体与DNA
‑
RNA杂合体结合的特异性和亲和力，而不是对整个三链R
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loop结构的识别。S9.6抗体与DNA
‑
RNA杂交链具有高亲和力(Knig F et al.,2017,PLoS One,12(6):e178875)，但对AT
‑
rich的双链RNA(dsRNAs)也具有一定的亲和力(Hartono S Retal.,2018,Journal of Molecular Biology,430(3):272
‑
284)，说明该方法存在潜在的特异性问题。由于S9.6抗体结合区域较大，可能会把R
‑
loop核心区域附近的双链DNA(dsDNA)一起沉淀下来，从而影响DRIP
‑
seq检测的精度。此外，超声波打断R
‑
loop区域时，可能会导致RNA链的迁移甩出，使单链DNA(ssDNA)重新退火，与模板链恢复dsDNA的状态，会引起检测出的R
‑
loop数量可能少于基因组中实际存在的R
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loop数量。另外，该方法所需要的初始DNA量较多(5
‑
8μg)。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种在全基因组水平鉴定植物R
‑
loop位点的方法；该方法可以在植物生理状态下鉴定全基因组R
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loop位点；该方法灵敏度高，可适用于起始DNA为100ng。
[000本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在全基因组水平鉴定植物R
‑
loop位点的方法，其特征在于，利用核糖核酸酶H特异性地识别并消化R
‑
loop结构中DNA
‑
RNA 杂合链，同时在DNA聚合酶I作用下，以DNA
‑
RNA杂合链中的DNA链为模板按照碱基配对方式及时修补被RNaseH切割的RNA位点，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基，最后，新合成的互补DNA链含有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基；利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段，结合单链DNA文库试剂盒构建单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定R
‑
loop位点；优选的，该方法主要包括如下步骤：(1)提取并纯化植物材料的细胞核；(2)提取基因组DNA；(3)将DNA片段化至100
‑
500bp，并利用琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果；(4)酶切并原位标记R
‑
loop位点；(5)回收反应后含有biotin标记的新合成的DNA；(6)利用高温将含有biotin标记的双链DNA变性成为单链DNA；(7)利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段；(8)利用单链DNA文库试剂盒构建含有biotin标记的单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定R
‑
loop位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中提取并纯化植物材料的细胞核的过程为：将植物材料用液氮充分研磨成粉末，向粉末中加入等体积的核提取缓冲液，充分搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃上清，得到细胞核沉淀；再加入细胞核清洗液重悬细胞核沉淀，再次离心，弃上清液，重复细胞核清洗过程直至细胞核颜色为白色或淡黄色，用RSB缓冲液重悬纯化后的细胞核，离心后弃尽上清；最后，保留沉淀，即纯化的细胞核；优选的，所述核提取缓冲液的配方为：20mM Tris
‑
HCl，50mM EDTA，5mM Spermidine，0.15mM spermine，40％Glycerol，0.1％Mercaptoethanol；优选的，所述细胞核清洗液的配方为：20mM Tris
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HCl，50mM EDTA，5mM Spermidine，0.15mM spermine，40％Glycerol，0.1％Mercaptoethanol，0.5％Triton X
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100；优选的，所述RSB缓冲液的配方为：10mM Tris
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HCl，10mM NaCl，3mM MgCl2。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中提取DNA方法为：向反应液中加入RNase A，于37℃水浴中孵育0.5～1h后，再加入Proteinase K及SDS于55℃水浴中孵育2h；用等体积的酚仿抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于
‑
20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，溶解于50μl EB缓冲液；优选的，所述EB缓冲液的配方为：10mM Tris
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HCl,pH 8.0。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中DNA片段化过程为：用EB缓冲液补齐DNA总体积在200μL，用非接触式超声波破碎仪，于4℃条件下进行片段化；用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化效果，用等体积的酚仿抽提，离心后保留上清液并加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于
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20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀，用75％酒精清洗干燥后，用20μl EB缓冲液溶解；优选的，破碎...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文利，杨滢，吴靖，韩琪，李梦琪，程雪姣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：