一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的方法和装置。该方法包括：向待测样本中添加设定终浓度的内参：栖热菌属菌种或噬菌体，然后进行宏基因组测序获得内参检出序列数和病原检出序列数；通过以下公式计算待测样本中病原核酸浓度：C

【技术实现步骤摘要】
一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的方法和装置


[0001]本专利技术涉及病原检测
，具体涉及一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的方法和装置。

技术介绍

[0002]宏基因组测序(Metagenomic Next
‑
Generation Sequencing，mNGS)是一种基于二代测序平台，直接对标本的所有基因组进行无差别测序的检测手段。mNGS应用于临床标本，可一网打尽检出病原体，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。但宏基因组测序是一种概率性的短读长片段化测序，不同标本的人源基因含量不同，导致标本中的病原载量占比也随之不同在规范的检测过程结束，只能明确检测到人源和病原基因片段数和二者在标本的比例。因此目前，mNGS存在无法对检出病原体绝对定量的技术壁垒，检出序列数因人源基因含量、标本DNA抽提、文库建立和生信分析等多环节的影响，无法在标本之间进行绝对量的比较。
[0003]内参是一类具有明确遗传序列且待测标本阴性的人工合成序列或者微生物(细菌、病毒等)，可被加入待检测的样本，以达在一次试验中对送检样品中的遗传物质进行全面的定性及定量分析的作用，从而校准mNGS测序结果。
[0004]DNA人工合成序列方面，James Blackburn已开发出一套由23种细菌和3种古菌组成的人工合成序列合集，用以相对定量环境菌群；细菌DNA方面，不少研究将费氏阿里弧菌(Alivibriofischeri)和沼泽红假单胞菌(Rhodoseudomonaspalustris)等菌所提取的DNA添加进标本作为宏基因组测序的内参，实现测序过程的质量控制。病毒方面，也曾有T1噬菌体和MS2噬菌体为组合作为mNGS质控内参的研究，但未进一步研究定量的效果。
[0005]申请号为CN202010383456.6的专利公开了一种基于内参进行宏基因组病原定量检测的方法，所采用的内参是人工合成的裸露DNA片段。该内参无完整微生物结构，无法模拟由于测序前处理步骤、标本破壁、DNA抽提和文库建立等过程中对结构完整病原体DNA载量的影响，以至于无法直接进行标本间绝对量的比较。
[0006]申请号为CN202210593922.2的专利公开了一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法，所采用的内参同样不具有完整微生物结构，同样无法进行标本间除血浆游离DNA外绝对量的比较。
[0007]国内外众多专利仍然缺乏宏基因组测序适用的、能对各种类型标本的完整病原体直接进行绝对定量的内参，市场上的现有产品和方法学也无法实现宏基因组测序病原体直接绝对定量，给临床诊断、治疗带来不便。

技术实现思路

[0008]为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的方法，通过在标本DNA提取之前，添加适量内参进行宏基因组测序，测序所得的病原体序列数可根据定量公式进行计算，从而得知标本病原体浓度。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]本专利技术的第一方面是提供一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的方法，包括：
[0011]向待测样本中添加设定终浓度的内参，然后进行宏基因组测序获得内参检出序列数和病原检出序列数；
[0012]通过以下公式计算待测样本中病原核酸浓度：
[0013]C
M
＝k
×
(C
IC
×
L
IC
×
N
M
)/(N
IC
×
L
M
)
[0014]其中，C
M
：病原浓度；C
IC
：内参浓度；L
M
：病原平均基因组长度；L
IC
：内参基因组长度；N
M
：病原检出序列数；N
IC
：内参检出序列数；k为常数，取值范围为0.1～20；
[0015]上述内参为栖热菌属(Thermus)菌种或噬菌体。
[0016]进一步地，待测样本选自组织、脑脊液、痰、肺泡灌洗液、全血、局灶感染的脓液、胆汁、粪便。
[0017]进一步地，上述内参为嗜热栖热菌，其保藏编号优选为CGMCC 1.15099（参见CN115044503A）。
[0018]进一步地，嗜热栖热菌的终浓度为102～106CFU/mL；优选为103CFU/mL.
[0019]进一步地，上述噬菌体为T1噬菌体DSM5801。
[0020]进一步地，上述噬菌体的终浓度为103～106PFU/mL，优选为104PFU/mL。
[0021]进一步地，上述方法包括如下步骤：
[0022](1)向待测样本中添加设定终浓度的嗜热栖热菌或T1噬菌体作为内参；
[0023](2)从添加内参的待测样本中提取游离DNA，并对上述游离DNA进行文库构建、上机测序及生物信息学分析得出内参检出序列数和病原检出序列数；
[0024](3)通过以下公式计算待测样本中病原核酸浓度：
[0025]C
M
＝k
×
(C
IC
×
L
IC
×
N
M
)/(N
IC
×
L
M
)
[0026]其中，C
M
：病原浓度；C
IC
：内参浓度；L
M
：病原平均基因组长度；L
IC
：内参基因组长度；N
M
：病原检出序列数；N
IC
：内参检出序列数；k为1。
[0027]进一步地，上述生物信息学分析包括：质量控制，包括过滤污染、去除低质量和低复杂性序列数；把质控后的序列数进行比对且去除宿主序列；将剩余的序列与病原体序列库(细菌、病毒、真菌和寄生虫)进行比对分析；分别统计样本中各个病原体的比对序列数。
[0028]本专利技术的第二方面是提供一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的系统，其包括：
[0029]测序数据获取单元，用于获取待测样本的测序文库的测序数据，该待测样本中添加有设定终浓度的栖热菌属菌种或噬菌体作为内参；
[0030]生物信息学分析单元，用于对上述测序数据进行生物信息学分析并获得内参检出序列数和病原检出序列数；
[0031]数据计算单元，用于通过以下公式计算出待测样本中病原核酸浓度：
[0032]C
M
＝k
×
(C
IC
×
L
IC
×
N
M
)/(N
IC
×
L
M
)
[0033]其中，C
M
：病原浓度；C
IC
：内参浓度；L
M
：病原平均基因组长度；L
IC
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于宏基因组测序绝对定量病原体的方法，其特征在于，包括：向待测样本中添加设定终浓度的内参，然后进行宏基因组测序获得内参检出序列数和病原检出序列数；通过以下公式计算待测样本中病原核酸浓度：C
M
＝k
×
(C
IC
×
L
IC
×
N
M
)/(N
IC
×
L
M
)其中，C
M
：病原浓度；C
IC
：内参浓度；L
M
：病原平均基因组长度；L
IC
：内参基因组长度；N
M
：病原检出序列数；N
IC
：内参检出序列数；k为常数，取值范围为0.1～20；所述内参为栖热菌属(Thermus)菌种或噬菌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本选自组织、脑脊液、痰、肺泡灌洗液、全血、局灶感染的脓液、胆汁、粪便。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参为嗜热栖热菌，其保藏编号优选为CGMCC 1.15099，其终浓度为102～106CFU/mL；优选为103CFU/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述噬菌体为T1噬菌体DSM 5801，其终浓度为103～106PFU/mL，优选为104PFU/mL。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)向待测样本中添加设定终浓度的嗜热栖热菌或T1噬菌体作为内参；(2)从添加内参的待测样本中提取游离DNA，并对所述游离DNA进行文库构建、上机测序及生物信息学分析得出内参检出序列数和病原检出序列数；(3)通过以下公式计算待测样本中病原核酸浓度：C
M
＝k
×
(C
IC
×
L
IC
×
N
M
)/(N
IC
×
L
M
)其中，C
M
：病原浓度；C
IC
：内参...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅掌璠，周旸，艾静文，崔鹏，许涛，仇超，张文宏，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：