一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法技术

本发明专利技术是用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，该方法包括如下步骤；步骤1、Spike

【技术实现步骤摘要】
一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法


[0001]本专利技术属于微生物
，特别涉及一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法。

技术介绍

[0002]随着高通量测序技术的不断发展，测序技术已成为环境微生物群落比较和差异分析的主流研究手段之一。微生物扩增子测序主要通过直接扩增环境总DNA的特定区域，解释某一特定样本环境微生物分布、丰度变化和群落组成情况。微生物扩增子测序主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及其他目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS某个高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用，同时也是系统发育和分类学研究中一种广泛使用的方法。
[0003]目前的16S rDNA可变区文库构建方法，一般是使用靶向扩增引物对某个或某几个可变区进行PCR扩增构建测序文库。构建文库过程通常包括两轮PCR扩增，第一轮PCR针对目标片段进行扩增，然后通过第二轮PCR扩增加上测序所需的通用接头。由于PCR扩增存在偏好性、不均一性，文库中的所有片段并非等量的被扩增。当涉及不同样本之间进行对比分析时，由于不同样本DNA纯度不一致，对PCR扩增的抑制效果不一样，导致PCR扩增效率也有很大差别，无法精确对不同样本的微生物量进行对比分析。
[0004]对样本的16S序列进行测序，得到成千上万条reads，在16S分析中引入OTU，首先对相似性(阈值一般为97％)序列进行聚类，分成数量较少的分类单元，基于分类单元进行物种注释。常规16S扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但是其是通过某一OTU分类单元的序列数所占总序列数的比值来获得某个细菌的相对丰度比例信息，然而相对丰度信息不能反映样本中物种真实的绝对丰度情况。
[0005]在微生物的研究中，通常可以观察到不同时刻菌群比例发生的变化，但却无法确定这种变化是由于菌群中所有菌株等量增殖，还是其中某一优势菌株优势增殖导致其他菌株抑制或是引入了同种外来细菌导致的，对菌株的鉴定则有助于研究菌群的变化机制、筛选突变菌株、研究相关疾病或感染的发病机制，进而研制出针对某一菌株的靶向药物，这些都必须依赖更加准确的测序数据。
[0006]人体肠道内存在大量微生物，这些微生物通过多种途径影响着人体健康，在人体的健康促进和疾病发生、发展中起着重要作用。肠道微生态平衡正成为人体健康的重要标志，维持肠道微生态的动态平衡，有助于人体抵御各种疾病的干扰，保持健康状态，维持肠道微生态的平衡主要是维持肠道菌群的数量保持在稳定健康数值范围内。然而，目前并无合适的微生物扩增子定量测序及分析方法，给微生物的定量测序及分析带来很多困扰。

技术实现思路

[0007]为了获得更加准确的数据、实现对细菌的定量检测，本专利技术的目的是提供一种微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，旨在提高微生物扩增子测序准确定量分析微生物丰度。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，该方法能够有效检测肠道菌群的数量进而评估人体肠道健康状况，有助于肠道健康管理。
[0009]为达到此目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，包括；
[0011]步骤1、Spike
‑
DNA的构建；
[0012]其中，Spike
‑
DNA设计了遵循三个原则：
[0013]1)与16S rRNA基因中用于鉴定原核微生物的引物有共同结合位点；
[0014]2)与16S rRNA基因检测区域长度相同，GC含量相近；
[0015]3)Spike
‑
DNA仅在样品中发现，不影响样品的原始微生物种组成。
[0016]原核16S rRNA V4区引物515F和806R是肠道菌群研究中常用的引物，基于16S rRNA V4区515F引物添加一段12bp特殊标签构造重组正向引物515FS(5
’‑
GTGCCAGCAGCCGCGGTAAGTCAGCTACTGA
‑3’
)；
[0017]利用重组正向引物515FS和806R(5
’‑
GGACTACNVGGGTWTCTAAT
‑3’
)从微生物阳性样品进行扩增、纯化和回收，得到纯的Spike
‑
DNA。
[0018]进一步，对Spike
‑
DNA进行浓度检测，根据公式：
[0019][0020]计算Spike
‑
DNA单位拷贝数，并进行梯度稀释备用。
[0021]步骤2、样品加入Spike
‑
DNA进行高通量测序文库构建；
[0022]待测样品基因组DNA提取并质检合格后，稀释至1ng/μl，待测样品基因组DNA中添加特定拷贝数的Spike
‑
DNA，用正向引物(Illumina adapter sequence 1+barcode+GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和反向引物(Illumina adapter sequence 2+barcode+GGACTACNVGGGTWTCTAAT)扩增待测样品微生物16S rRNA基因V4高变量区(515F/806R)。
[0023]PCR反应体系为20μl，反应体系如下：
[0024]试剂名称体积PCR扩增反应液10μl正向引物(终浓度0.25mM)0.5μl反向引物(终浓度0.25mM)0.5μl无菌去离子水6μlSpike
‑
DNA1μl待测样品基因组DNA2μl
[0025]体系配制完成后，按照以下反应条件，在PCR仪上进行反应：
[0026][0027]上述反应产物用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶进行检测，针对目的条带采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收。每个待测样品进行浓度检测、均一化后，混合组成一个混合文库，在Illumina MiniSeq平台上使用PE150模式进行测序。
[0028]步骤3、高通量测序数据分析及校正；
[0029]样品中加入了Spike
‑
DNA，测序数据经过拆分和去除低质量数据后，使用flash软件对原始的双端reads进行组装，然后对Spike
‑
DNA的测序数据进行统计和去除，使用USEARCH软件按照默认参数对clean tags进行嵌合体检查，以97％的相似度进行OTU聚类；在得到OTU表后，根据绝对定量的方法将其转化为绝对丰度表。
[0030]由于每个样品加入的Spike
‑
DNA的量一样，最后经过测序得到的Spike
‑
DNA的reads数是一致的，经过大样本测试，Spike
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤；步骤1、Spike
‑
DNA的构建；基于16S rRNA V4区515F引物添加一段12bp特殊标签构造重组正向引物515FS(5
’‑
GTGCCAGCAGCCGCGGTAAGTCAGCTACTGA
‑3’
)；利用重组正向引物515FS和806R(5
’‑
GGACTACNVGGGTWTCTAAT
‑3’
)从微生物阳性样品进行扩增、纯化和回收，得到纯的Spike
‑
DNA；步骤2、样品加入Spike
‑
DNA进行高通量测序文库构建；待测样品基因组DNA提取并质检合格后，待测样品基因组DNA中添加特定拷贝数的Spike
‑
DNA，用正向引物(Illumina adapter sequence 1+barcode+GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和反向引物(Illumina adapter sequence 2+barcode+GGACTACNVGGGTWTCTAAT)扩增待测样品微生物16S rRNA基因V4高变量区(515F/806R)；步骤3、高通量测序数据分析及校正；样品中加入了Spike
‑
DNA，测序数据经过拆分和去除低质量数据后，使用flash软件对原始的双端reads进行组装，然后对Spike
‑
DNA的测序数据进行统计和去除，使用USEARCH软件按照默认参数对clean tags进行嵌合体检查，以97％的相似度进行OTU聚类；在得到OTU表后，根据绝对定量的方法将其转化为绝对丰度表。2.根据权利要求1所述的用于微生物扩增子高通量定量测序及分析方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帮周，林爱强，罗联根，肖传兴，柯栋贤，梁银龙，
申请(专利权)人：厦门承葛医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：