一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用，磁珠的制备方法为：以羧基化交联聚苯乙烯微球为模板，将Fe3O4负载到溶胀的微球模板上形成微球组装体；然后在含有PEI不良溶剂中，组装油酸修饰的疏水Fe3O4；之后进行微球组装体从有机相到水相的相转移，接着生长二氧化硅壳层，最后依次经氨基化修饰和羧基化修饰，得到羧基化的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠。本发明专利技术以羧基化交联聚苯乙烯微球为模板，以溶胀法和层层自组装法负载Fe3O4粒子，通过微球外包硅实现生物相容性，提供一种尺寸均匀、磁分速度快、沉降时间慢、生物相容性好、检测性能好的分析磁珠，应用于与ELISA结合的检测中具有很好的技术效果。有很好的技术效果。有很好的技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]PCT(降钙素原，procalcitonin)是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高，因此它可以帮助鉴别细菌和病毒感染。PCT在一些非感染类的疾病也可能会升高，比如手术之后、严重的创伤、烧伤、重症胰腺炎、持续性心源性休克等也会升高，这时就需要和细菌感染来鉴别。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。
[0003]病原微生物仍是细菌感染诊断的金标准，但此方法检测时间长。临床怀疑是细菌感染性疾病的患者及时检测PCT，有助于细菌感染性疾病的早期诊断，并且PCT可指导临床抗生素的应用。
[0004]准确区分低浓度范围内的PCT水平对指导合理抗生素治疗具有重要意义。《降钙素原PCT急诊临床应用的专家共识》和《下呼吸道感染的国家抗生素指南和降钙素原抗生素处方指南》指出：当血清中PCT水平低于0.1ng/mL时，强烈不推荐使用抗生素；血清中PCT水平为0.1
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0.25ng/mL时，不推荐使用抗生素；血清中PCT水平为0.25
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0.5ng/mL时，建议使用抗生素；血清中PCT水平大于0.5ng/mL时，强烈建议使用抗生素。
[0005]有关PCT的免疫检测分析方法有免疫荧光法、免疫化学发光法、酶联免疫吸附测定(ELISA)。其中免疫荧光法作为一种定量的免疫化学检测方法，可以针对抗原以及抗体的高特异性，预先在聚酷膜上包被有金标记降钙素原(PCT)的单克隆抗体和样本中的降钙素原结合。而后利用相关的仪器对检测区域进行扫描，进一步识别发光信号。通过将发光信号强度与PCT进行比较，对PCT标准浓度进行测定，同时制备曲线，进而得到标本的PCT浓度值，该种方法通常较为简单而且具有一定的高精度特点，同时可重复进行操作，目前被广泛应用到实验室操作过程中，但是该种检测方法具有一定的局限性，主要体现在会出现假阴性或假阳性的结果。免疫化学发光法在进行检测过程中使用光标记抗体，另一抗体于试管内壁进行固定。该种诊断方法具有一定的特异性，同时又具备一定的高敏感性且操作简单，测量底线值较低，但发光试剂通常热稳定性较差，不便于长期保存。酶联免疫吸附测定是把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体结合。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
[0006]免疫磁珠以其便于分离的特点在免疫分析领域中得到了广泛的应用。与常规检测模式相比相比，免疫磁珠的使用可实现目标物磁富集以提高信号灵敏度，可将捕获抗体偶
联在磁珠上，简化了传统免疫测定需将抗体偶联在酶标板或试管中的步骤，同时在复杂溶液中也可实现抗原
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抗体特异性结合和复合物的快速分离，减少了测试时间，简化了分离步骤。
[0007]目前免疫磁珠结构一般分为弥散型、核壳型、夹心型三种。弥散型磁珠中磁微粒分布在磁珠内部，其制备方法一般是在将聚合物微球造孔形成多孔微球再原位生长磁性物质，也有在聚合物合成的同时通过原位聚合将制备好的磁性物质包埋。核壳型免疫磁珠合成方法是先合成单颗粒磁性物质，再在外层包覆亲水性聚合物涂层。夹心型免疫磁珠内核为聚合物微球，中间层负载磁性粒子，最外层包覆亲水性聚合物。
[0008]国外著名磁珠品牌有美国赛默飞、日本JSR等。赛默飞旗下有关免疫磁珠子品牌有：Thermo Scientific
TM
、Invitrogen
TM
，其中Invitrogen旗下Dynabeads为其王牌免疫磁珠产品，My one
TM
系列磁珠更是被广泛用于科研及实际免疫分析检测，磁珠主要是以多孔微球作为模板，在孔道内原位生长磁性粒子，形成弥散型免疫磁珠，磁微粒均匀负载在微球内。但还存在着一些缺点，例如不能控制磁微粒负载量，且多孔微球制备过程复杂，原位生长难度较大，导致其成本及售价较高。
[0009]目前国内也有许多公司研发生产免疫磁珠，主要分为硅基磁珠和聚合物磁珠，但由于硅基磁珠批批间差异大、微球粒径不均一、单分散性差主要被用于核酸提取方向。国内较为领头的免疫磁珠公司有：博岳、苏州纳微、海狸等。博岳磁珠与Thermo Dynabeads有着相类似的弥散式结构，磁核材料为超顺磁性γ
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Fe2O3纳米颗粒，氧化铁含量在15％
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20％。苏州纳微研发的磁性聚合物微球为夹层型结构，内部为多孔聚合物微球内核，外部包覆不同材质的聚合物包层以满足不同应用需求，磁性材料填充于二者之间的孔隙中，该系列微球直径介于1.0
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5.0μm之间。但制备多孔聚合物微球需要进行造孔操作，增加了生产成本，且无法保证造孔均匀。海狸BeaverBeads
TM Mag COOH系列磁珠是以Fe3O4为磁核、聚合物为外壳，但这对合成单颗粒Fe3O4的分散度要求较高，否则容易引起Fe3O4磁核团聚而导致微球粒径不均一。
[0010]因此基于上述免疫磁珠技术的缺点，本专利技术介绍了一种溶胀和层层组装负载Fe3O4，利用交联聚苯乙烯微球在良溶剂中溶胀和在不良溶剂中收缩的特性将Fe3O4溶胀在微球中，赋予交联聚苯乙烯微球磁性，再通过PEI与Fe3O4的金属
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配基亲和驱动组装，增加微球磁分性能。随后对组装体进行表面修饰使其可在水介质中稳定存在，并进一步将其用于酶联免疫吸附测定(ELISA)检测PCT。制备得到的交联聚苯乙烯分析磁珠尺寸均匀、磁分速度快、沉降时间慢、生物相容性好。为产业化分析磁珠提供一种有力的制备方法。

技术实现思路

[0011]针对现有技术存在的上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠及其制备方法和应用。本专利技术以羧基化交联聚苯乙烯微球为模板，以溶胀法和层层自组装法负载Fe3O4粒子，通过微球外包硅实现生物相容性，提供了一种尺寸均匀、磁分速度快、沉降时间慢、生物相容性好，检测性能好的分析磁珠。
[0012]本专利技术采用的技术方案如下：
[0013]所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于以羧基化交联聚苯乙烯微球为模板，将微球模板在良溶剂中室温下溶胀过夜
后，加入Fe3O4纳米粒子超声，使Fe3O4纳米粒子负载到溶胀的微球模板上形成微球组装体PS
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MNPs；然后不良溶剂收缩微球，之后在含有PEI的不良溶剂中，利用PEI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于以羧基化交联聚苯乙烯微球为模板，将微球模板在良溶剂中室温下溶胀过夜后，加入Fe3O4纳米粒子超声，使Fe3O4纳米粒子负载到溶胀的微球模板上形成微球组装体PS
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MNPs；然后不良溶剂收缩微球，之后在含有聚乙烯亚胺PEI的不良溶剂中，利用PEI与Fe3O4的金属
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配基亲和驱动组装油酸修饰的疏水Fe3O4磁性纳米粒子，形成第二层Fe3O4纳米粒子的负载，以增加微球的磁性；之后利用正辛基三甲氧基硅烷OTMS在微球组装体表面发生水解缩合反应，实现微球组装体从有机相到水相的相转移，接着通过硅酸四乙酯TEOS在其表面水解生长二氧化硅壳层，制备得到表面有二氧化硅层的交联聚苯乙烯分析磁珠，最后依次经氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰和琥珀酸酐进行羧基化修饰的操作，使微球表面进一步经氨基
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羧基化修饰，得到羧基化的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠，即制备完成。2.如权利要求1所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于所述羧基化交联聚苯乙烯微球的制备方法为：将聚乙烯吡咯烷酮按照1 g:60~80 mL的固液比溶解在体积比8~10:1的乙醇
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水混合液中，在氮气保护氛围下，升温至65
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75℃后，加入苯乙烯、偶氮二异丁腈和丙烯酸，250
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300 rpm下搅拌反应3~5h后，逐滴加入溶有二乙烯基苯的无水乙醇，滴加完毕后，反应溶液继续搅拌，反应时长为20~30h；待反应结束后，离心分离出固体并用乙醇洗涤数次，最后将合成的聚苯乙烯微球干燥，即制备完成；其中，聚乙烯吡咯烷酮、苯乙烯、偶氮二异丁腈、丙烯酸和二乙烯基苯五者的投料比为（0.6~0.8）g：（6~7）mL：（0.07~0.1）g：（0.15~0.3）mL：（2~4）mL。3.如权利要求1所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于所述良溶剂为甲苯，所述微球模板与第一层Fe3O4纳米粒子的质量比为10：6~10，优选为10：8；所述不良溶剂为乙醇。4.如权利要求1所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于负载第二层Fe3O4纳米粒子的过程包括以下步骤：1）将负载第一层Fe3O4纳米粒子的微球组装体PS
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MNPs，分散在含有PEI的乙醇溶液中，微球组装体PS
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MNPs与PEI的质量比为1.2
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1.5：1，旋转孵育1
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3 h后，磁分；2）步骤1）所得微球分散在体积比1:2~4的甲苯
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己醇混合液中，加入油酸修饰的疏水Fe3O4磁性纳米粒子，旋转孵育1
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3 h后，磁分，即得到负载两层Fe3O4纳米粒子的微球组装体；步骤2）中微球与油酸修饰的疏水Fe3O4磁性纳米粒子的质量比为1.5
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2.5:1。5.如权利要求1所述的一种基于溶胀和层层组装的“夹心型”交联聚苯乙烯分析磁珠的制备方法，其特征在于通过OTMS在微球组装体表面发生水解缩合反应，以及在表面水解生长二氧化硅壳层的具体过程为，包括以下步骤：S1：向微球组装体中...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪晶，田甜，黄亮，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：