本发明专利技术涉及提供一种通过诱导体细胞胚和植株再生的方式快速大量的繁育银粉背蕨的方法，包括：１）愈伤组织的诱导与增殖；２）胚性愈伤组织的诱导与增殖；３）体细胞胚的诱导；４）再生植株诱导。本发明专利技术解决了目前银粉背蕨自然成苗率低、成苗周期长和繁殖系数低的问题，与利用孢子繁殖的常规方法相比，投入少，繁殖速度快，增殖倍数高，稳定性好，可大量生产与保留母本优良性状的再生植株，成苗率提高了１０～１５倍。而且本发明专利技术的方法为银粉背蕨的改良、转基因受体和突变体的筛选提供了良好的无性繁殖实验体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物繁殖领域，具体的说，涉及一种银粉背蕨的快速 繁殖方法。
技术介绍
乡土观叶植物的推广与应用是国内园林绿化的热点研究领域之 一。观叶植物大致分为两种类型， 一类是色彩斑斓的彩色叶植物，另 一类是具有纯朴色彩和优美姿态的绿叶植物。在后者中，蕨类植物以 其古朴、典雅、轻盈及线条和谐的特点独辟一族，被誉为植物王国中 超凡脱俗的高士，深受人们的喜爱。我国虽然有丰富的野生蕨类植物资源，但目前仅有十来种蕨作为 小盆栽或插花配材见于花弁巿场，而且远没有形成规模，这与我国相 对薄弱的繁殖技术有关。蕨类植物是最低级的高等植物，用孢子繁衍 后代，其有性生殖过程要求严格的荫湿环境，虽然其孢子产量大，但 配子体受精率和成苗率均低，且成苗时间长。因此蕨类植物大规模的 育苗必须采用其它科学有效的方法。银粉背蕨(y4/e紹'to/^en's )是中国蕨禾斗(Sinopteridaceae )粉背蕨属的一种多年生小型石生蕨，属于东亚分布型种，分布于我囯 南北大部分地区。银粉背蕨叶型、叶色奇特，株形小巧而飘逸，其生 态适应性强，喜阳也耐荫，耐寒且尤为耐旱，还是一种钙质土指示植 物。因此银粉背蕨既适于作室内盆栽、插花配叶，也是作水石盆景绿 化、屋顶绿化和林缘地被的好材料。目前银粉背蕨已经得到了一些学 者和商家的青睐，但因为缺乏科学有效的繁殖技术作指导，始终无法 在巿场上对其进行大量推广。因此釆用科学有效的快速繁殖技术将极 大的促进银粉背蕨在园林中的应用与推广。4植物体细胞胚的发生在植物组织培养中是非常普遍的现象，它与 器官分化方式相比，具有数量多、速度快、结构完整和再生率高等优 点。而且体细胞胚的诱导为人工种子研制、优良种质的无性繁殖、植 物转基因和突变体筛选等提供了材料和技术基础。在蕨类植物的组织培养中，通过在其外殖体上诱导GGB (Green Globular Body)来提高繁殖系数已屡见报道。但由于不同种类特性的巨大差异，诱导和增殖 所采用的原种、培养基、培养条件以及得到的具体结果都有很大的差 别。因此，有必要提供一种银粉背蕨的快速繁殖方法。
技术实现思路
针对银粉背蕨在繁殖中存在的上述问题，本专利技术提供了一种通过 诱导体细胞胚和植株再生的方式快速大量的繁育银粉背蕨孢子体苗 的方法。本专利技术所述的方法，以成熟原叶体作为外殖体，包括以下步骤 1)愈伤组织的诱导与增殖；2)胚性愈伤组织的诱导与增殖；3)体 细胞胚的诱导；4)再生植株诱导。其中，步骤l)所述愈伤组织的诱导包括取成熟原叶体，将原 叶体接种至添加0.5mg/l 2.0mg/16-糠基腺嘌呤(简称KT), 0.5 2.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D)的MS培养基中进行培养，至原叶体 的腹部形成黄绿色的愈伤组织块。步骤1 )所述愈伤组织的增殖包括将愈伤组织块接种到所述培 养基中继代培养，得大量增殖的愈伤组织。实验证明，当KT和2，4-D的浓度比为1:1时，愈伤组织诱导率 和增殖率均最高。因此，所述步骤1)优选添加浓度比为1:1的KT 和2,4-D的MS培养基。需要注意的是，在此培养基中继代增殖时间不能超过3个月，否 则愈伤组织团细胞不能分化为胚性细胞。步骤2)所述胚性愈伤组织的诱导包括将愈伤组织继代到添加 含6-节基嘌呤(简称6-BA) 1.0 2.0mg/l,磷酸二氢钠125 500mg/l 的MS培养基中培养，至愈伤组织转化为易于脱落、颗粒性更明显的 黄色胚性愈伤组织团，得到胚性愈伤组织。步骤2)所述胚性愈伤组织的增殖包括在上述培养基(添加 1.0 2.0mg/16-节基嘌呤(简称6-BA)， 125~500mg/l磷酸二氢钠的 MS培养基)中继代培养2 4次，得大量增殖的胚性愈伤组织。步骤3)所述体细胞胚诱导包括将胚性愈伤组织接种到添加 0 0.5mg/l 6-节基嘌呤的MS培养基中，培养至形成绿色、颗粒紧 致的体细胞胚。所述4)再生植株诱导包括将体细胞胚接种到MS基本培养基中， 不添加激素，培养至体细胞胚团分化出芽丛和根，形成小苗。上述步骤l), 2)， 3)和4)中，所述培养采用特定成分的固体或 液体MS培养基培养，优选液体悬浮培养；釆用液体MS培养基，所述 培养的培养条件为培养温度22 26。C，光照强度800 ~ 16001ux,光 照时间16h/d的条件下进行振荡培养；旋转震荡器转速 120r/min~160r/min，每10d继代l次；釆用固体MS培养基，所述培养的培养条件为培养温度22 26"C, 光照强度2000 24001ux，光照时间16h/d;每月继代1次。本专利技术所述的方法，在步骤l)之前，还包括原叶体的诱导与 增殖。其中，所述原叶体的诱导包括取成熟孢子，用离心法在NaClO 水溶液中灭菌l-5min，然后接种到蔗糖和琼脂浓度分别为30g/l和6g/1 的MS固体培养基中，在培养温度22~26°C ,光照强度2000 ~ 24001ux, 光照时间16h/d的条件下培养，直至配子体发育为成熟的原叶体；所述原叶体的增殖包括将成熟的原叶体接种到蔗糖浓度30g/l 的MS液体培养基中，在培养温度22 26。C，光照强度800 16001ux，光照时间16h/d的条件下进行振荡培养。本专利技术所述的方法，在步骤4)之后，还包括再生植株基质移 栽培养。所述再生植株基质移栽培养为当步骤4)的小苗长到2-4cm高时， 在自然光照下炼苗5-10天后移栽，，然后去除其根部的培养基，在湿 度60-95%、温度24-28。C的条件下培养。上述繁殖方式中用来诱导愈伤组织的原叶体必须发育成熟，即形 成精子器和颈卵管(可在显微镜下观察)，否则未完成受精的原叶体 将一直停留在配子体世代，只进行营养生长而不能转化。2，4-D对银粉背蕨愈伤组织的诱导起关键作用，培养基中不添加 2,4-D时不能形成愈伤组织，但诱导胚性愈伤组织时必须除去2,4-D。6-BA能极大的促进胚性愈伤组织的诱导、增殖与转化，但6-BA 的含量太高或太低时将抑制其增殖。液体悬浮培养是一种有效的扩繁方式，其优点在于能使培养材料 充分与培养基接触，促进细胞的生长与分化，因此繁殖系数非常大。 1个lcmx lcm大小的原叶体团最后能分化出上百颗胚性愈伤组织，而胚性愈伤组织的增殖率和转化率也很高。但液体培养容易污染，接 种时必须非常小心。上述专利技术中，釆用的MS液体或固体培养基的基本配方为配制l 升(1000毫升)培养基，加硝酸铵1.65g、硝酸钾1.9g、氯化钩0.44g、 硫酸镁0.37g、磷酸二氢钾0.17g、碘化钾0.83mg、硼酸5.2mg、硫酸镁 22.3mg、硫酸锌3.6mg、钼酸钠0.25mg、硫酸铜0.025mg、氯化钴 0.025mg、硫酸铁27.8mg。如无特别指明，上述各步骤釆用培养基的 琼脂和蔗糖浓度分别为6g/l和30g/1,液体培养基中不添加琼脂。如无特别指明，固体MS培养基的配制方法为先将琼脂溶化， 再加入在水中溶解的各种营养元素和蔗糖，然后用氢氧化钠或盐酸调 整培养基的pH, —般为5.8~6.0，配好后经高压灭菌。冷却后放到培养室预培养3天，如没有杂菌污染，可用于原种材料的接种。各步骤用特定成分的固体或液体MS培养基培养，优选液体悬浮培养。液体MS培本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种银粉背蕨的繁殖方法，其特征在于，以成熟原叶体作为外殖体，包括以下步骤：１）愈伤组织的诱导与增殖；２）胚性愈伤组织的诱导与增殖；３）体细胞胚的诱导；４）再生植株诱导。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董丽，张启翔，黄笛，冯玉兰，程堂仁，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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