一种用于裂解液分析的整体床的合成方法，属于生物分子分析和色谱分析技术领域。该方法将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物；然后将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床；聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性；修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床。实现该发明专利技术的关键点在于控制整体床的孔结构和修饰密度。采用本方法所合成的整体床在裂解液分析中可以对于未经预处理的含有大量杂质的裂解液进行分析，分析过程方便快捷，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物分子分析技术及色谱分 析领域。
技术介绍
基因治疗和DNA疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病 的诊断和治疗方面的应用研究正日益引起越来越广泛的关注。目前质粒逐渐成为基因治疗的 最重要的基因传递系统，因此应用于基因治疗的药用质粒的大规模制备成为其基础。而药用 质粒的大规模制备过程的关键之一在于如何监测质粒纯度、监测质粒制备过程的性能，评价 最终产品质量以及产品的规格等，这对于过程开发、认证、产品批准非常重要。典型的质粒大规模制备过程包括发酵、细胞收获、细胞裂解、澄清与浓縮和纯化等步骤。 其中裂解步骤可以去除全部细胞碎片，去除部分gDNA、 RNA、蛋白等杂质，所得到的裂解 液除了含有各种拓扑形态的质粒异构体、变性DNA (变性gDNA、变性质粒)之外，仍含有 人量杂质，如gDNA、高分子量RNA、低分子量RNA、蛋白、内毒素等。该过程对质粒收率 和质粒产品的质量影响很大，是目前研究者关注的焦点。在质粒制备过程流分析中因碱裂解 液中杂质含量高，其分析最为困难。目前应用于裂解液分析的色谱法包括反相色谱、疏水相互作用色谱、体积排阻和离子交 换色谱等多种模式。离子交换色谱在裂解液分析中应用最为广泛。应用于裂解液分析过程的 阴离子交换型色谱介质均为商业化产品，其中大多数是为蛋白质分离分析而开发，主要有多 孔微球、灌注色谱填料、非多孔色谱填料和薄壳色谱填料等，为提高传质性能而开发的各种 新型色谱介质是其中的主体。裂解液分析是质粒制备过程流分析中重要且难于分析的部分。 因裂解是质粒制备过程的第一个步骤，而且该步骤对质粒的收率影响很大，该部分是目前质 粒制备研究的重点之一。裂解液中通常除目标质粒外，还含有高分子量RNA、低分子量RNA、 gDNA、蛋白和内毒素。将质粒和蛋白、RNA、 gDNA等杂质有效分离是色谱柱准确定量质粒 的前提。质粒与蛋白和低分子量RNA的分离比较容易，但是质粒与高分子量RNA的分离比较 困难，特别是未经纯化的裂解液，因样品中高分子量RNA含量很高，与质粒共洗脱形成宽峰， 一般的色谱柱均无法实现分离。为精确定量裂解液中质粒含量，通常采用RNase酶解将高分 子量RNA降解为寡核苷酸。目前尚未见采用色谱柱直接对含有大量RNA样品的裂解液进行分 析的报道。3专利技术人在"Zhang M L, Sun Y. Poly(glycidyl methacrylate ~divinylbenzene -triallylisocyanurate) continuous-bed protein chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHYA. 2001,912(1): 31-38"和"张敏莲，白姝，孙彦.聚(GMA-DVB-TAIC) 型连续床的制备及其对蛋白质的色谱分离性能.离子交换与吸附，2003， 16(3) : 199 206"中曾针对蛋白质分离分析开发了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一二乙烯基苯一三聚异氰尿酸三 烯丙酯)型整体床，该整体床具有良好的亲水性能。但由于该整体床针对蛋白分离分析开发， 整体床中的孔径为l 2nm，虽然在蛋白分离中可以具有良好的传质性能，但因质粒的长度可 达几百纳米，窄的部分可达十几纳米，而裂解液中还含有大量的高分子量杂质，如高分子量 RNA和gDNA，因此该类型整体床在裂解液分析中传质性能差，易出现色谱柱堵塞，而无法 应用于裂解液的分析。
技术实现思路
针对目前裂解液分析中需要对其进行预处理、传质性能差和色谱柱易污染的问题，本发 明的目的是提供一种具有适宜修饰密度、不易被污染、具有大量质粒可以进入的孔道、传质 速度快，背压低，可直接用于裂解液分析的整体床的合成方法。实现该专利技术的关键点在于控 制整体床的孔结构和修饰密度，即选取适宜的聚合条件和修饰条件。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的，其特征在于该方法包括如下步骤1) 将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致 孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中a. 所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05 0.2;b. 所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40 80%;c. 所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005 0.03;2) 将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床，聚合 温度控制在50 6(TC之间，反应时间为12 72小时；3) 聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；4) 利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性，其中胺类修饰剂的体积含量为 25 75%，修饰温度控制在50 6(TC之间，反应时间为3 9小时；5) 修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床。上述技术方案中，所述交联剂采用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合 物，两类交联剂的物质的量的比为0.25 4;所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种； 所述的引发剂采用偶氮类物质；所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种。所述含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和双甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一种；所述含有三个双键的化合物采用三聚异腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一种。所述偶氮类物质采用偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的任一 种。所述饱和烃采用正庚烷、正辛垸和正壬垸中的任一种；所述芳烃采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一种。所述醇类采用乙醇或甲醇；所述环醚类采用四氢呋喃或二噁烷。所述胺类修 饰剂采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一种。本专利技术与现有技术中裂解液分析方法相比，具有以下优点及突出性效果该种类型的整 体床具有适宜的修饰密度、不易被污染、具有大量质粒可以进入的孔道、传质速度快、背压 低、可以对于未经预处理的含有大量杂质的裂解液进行多个批次的分析而分析柱性能无明显 改变，在裂解液分析中具有良好的耐污染能力，分析过程方便快捷，成本低。 具体实施例方式本专利技术提供，其特征在于该方法包括如下歩骤:1) 将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致 孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中a. 所述交联剂与单体的物质的量的比为0.05 0.2;b. 所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的40 80%;c. 所述引发剂与单体的物质的量的比为0.005 0.03;2) 将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床，聚合 温度控制在50 6(TC之间，反应时间为12 72小时；3) 聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床；4) 利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性，其中胺类修饰剂的体积含量为 25 75%，修饰温度控制在50 6(TC之间，反应时间为3 9小时；5) 修饰反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床。 所述交联剂采用含有两个双键的化合物和三个双键的化合物的混合物，两类交联剂的物质的量的比为0.25 4;所述的致孔剂采用饱和烷烃和芳烃中的至少一种；所述的引发剂采用 偶氮类物质；所述的有机溶剂为醇类和环醚类中的任一种。所述含有两个双键的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和双甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一种；所述含有三个双键的化合物采用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于裂解液分析的整体床的合成方法，其特征在于该方法包括如下步骤： １）将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中： ａ．所述交联剂与单体的物质的量的比为０．０５～０ ．２； ｂ．所述致孔剂用量占反应混合物体积含量的４０～８０％； ｃ．所述引发剂与单体的物质的量的比为０．００５～０．０３； ２）将上述反应混合物超声混和均匀，加入到色谱柱管中，原位聚合形成整体床，聚合温度控制在５０～６０℃之间，反应时 间为１２～７２小时； ３）聚合反应结束后，利用有机溶剂冲洗整体床； ４）利用溶于有机溶剂的胺类修饰剂对整体床进行改性，其中胺类修饰剂的体积含量为２５～７５％，修饰温度控制在５０～６０℃之间，反应时间为３～９小时； ５）修饰反应结束后， 利用有机溶剂冲洗整体床。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张敏莲，徐青，花秀夫，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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