一种重组蛋白、单克隆抗体及其检测试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种MMP11重组蛋白，所述的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的重组蛋白密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术同时公开了一种检测MMP11蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的重组蛋白和有效量的特异性结合所述重组蛋白的单克隆抗体以及配套的检测试剂，所述的特异性结合所述重组蛋白的单克隆抗体为单克隆抗体1B2、单克隆抗体4C8，其中单克隆抗体1B2、单克隆抗体4C8的重链可变区序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；单克隆抗体1B2、单克隆抗体4C8的轻链可变区序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术制备的重组蛋白和单克隆抗体以及在此基础上制备的试剂盒，具有良好的敏感性和准确性，适合用于MMP11蛋白的检测。适合用于MMP11蛋白的检测。适合用于MMP11蛋白的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白、单克隆抗体及其检测试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种重组蛋白、单克隆抗体及其检测试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]肺癌是导致癌症死亡的主要原因之一，其病因尚很不清楚。有文献报道(CN200710111205等)通过转录组微阵列数据，分析差异表达基因，识别具有治疗潜力的肺腺癌的关键驱动基因。细胞学实验表明，基质金属蛋白酶11(matrix metallopeptidase 11，MMP11)显著抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在异种移植瘤模型中也获得了一致的结果。用抗MMP11抗体处理不同的人肺腺癌细胞系，可明显延缓细胞的生长和迁移。
[0003]因此，MMP11有可能是肺癌的一个筛选靶点或治疗靶点。但，现在还没有相关的诊断试剂或诊断材料。

技术实现思路

[0004]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种MMP11重组蛋白及其制备方法和应用；本专利技术的目的之二在于提供一种MMP11的单克隆抗体及其制备方法和应用。
[0005]因此，本专利技术一方面提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白为MMP11重组蛋白，所述的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]优选地，本专利技术所述的重组蛋白密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]再一方面，本专利技术还提供了一种用于检测MMP11蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的所述的重组蛋白和有效量的特异性结合所述重组蛋白的单克隆抗体以及配套的检测试剂。
[0008]优选地，本专利技术所述的特异性结合所述重组蛋白的单克隆抗体为单克隆抗体1B2、单克隆抗体4C8，其中单克隆抗体1B2、单克隆抗体4C8的重链可变区序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，单克隆抗体1B2、单克隆抗体4C8的轻链可变区序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0009]再一方面，本专利技术还提供了一种所述的重组蛋白在制备MMP11蛋白检测试剂中的应用。
[0010]再一方面，本专利技术还提供了一种所述的单克隆抗体1B2、单克隆抗体4C8在制备MMP11蛋白检测试剂中的应用
[0011]本专利技术公开的MMP11重组蛋白具有良好的免疫原性，可用于制备MMP11蛋白的检测试剂(如校准品或单克隆抗体的免疫原)。另外，本专利技术在制备的MMP11重组蛋白的基础上，筛选了2株特异性结合MMP11蛋白的单克隆抗体，这2株单克隆抗体具有良好的敏感性和特异性，适用于制备MMP11蛋白的检测试剂。
[0012]本专利技术在制备的重组蛋白和单克隆抗体的基础上，开发了用于MMP11蛋白检测的
试剂盒，该试剂盒具有较高的灵敏度和准确性。因此，该试剂盒具有较好的适用性。
附图说明
[0013]图1去除信号肽的MMP11蛋白无序区分析结果。分值越高代表该位置为无序区的概率越大，0.5作为是否为无序区的分界线。
[0014]图2MMP11重组蛋白SDS
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PAGE图，其中1是纯化后的MMP11重组蛋白。
[0015]图3单克隆抗体制备生产模式图。
[0016]图4试剂盒标准曲线。
具体实施方式
[0017]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0018]除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0019]实施例1：MMP11重组蛋白设计和制备
[0020]从NCBI(GenBank:KAI6060526.1)中挑选1个MMP11蛋白作为研究对象，首先，对MMP11蛋白的信号肽进行分析，有信号肽的概率为:99.115％,信号肽类型：SP(Sec/SPI)；切割位点：35
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36,概率：76.780％；因此，去除N端35个氨基酸，对剩余序列进行蛋白无序区的分析，结果显示(图1)，aa1～aa70和aa225～aa260为无序区的概率较大，因此，去除这2个区域的氨基酸，对剩余的序列进行MMP11重组蛋白的制备，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0021]将密码子优化后的MMP11重组蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.2所示)克隆到真核表达载体(如pEE12.4或pCDNA3.1等)中。以密码子优化的MMP11重组蛋白核苷酸序列为模板，分别用EcoRI和HindⅢ双酶切位点进行连接以构建含6His的重组表达质粒。将鉴定为阳性的重组质粒经测序检验正确后进行MMP11重组蛋白的表达。后续参照201611208261.8实施例1～6制备MMP11重组蛋白。
[0022]经过筛选后，共筛选到1株稳定分泌表达MMP11重组蛋白的CHO
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K1细胞株，其表达产量能达到280mg/L或以上；经镍柱纯化后的MMP11重组蛋白的SDS
‑
PAGE纯度能达到90％以上(图2所示)，SDS
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PAGE分子量(图2所示)约为42kDa，比预测的分子量稍大，说明该重组蛋白有糖基化修饰。
[0023]实施例2：MMP11重组蛋白单克隆抗体的制备
[0024]使用实施例1制备的MMP11重组蛋白制备MMP11单克隆抗体。具体方法为常规的小鼠杂交瘤细胞技术(模式图如图3所示，来源于知乎)，其简述如下：
[0025]1、动物免疫：选用6～8周龄雌性Balb/c小鼠，按照制定的免疫方案进行免疫注射(一般免疫3次，在初次免疫2～3周后进行再次免疫，在再次免疫3周后进行加强免疫)，在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合。
[0026]2、细胞融合：采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促
融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
[0027]3、选择性培养：一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤
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鸟嘌呤
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磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤
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鸟嘌呤
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磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
[0028]4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，所述重组蛋白为MMP11重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种检测MMP11蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的权利要求1所述的重组蛋白和有效量的特异性结合权利要求1所述重组蛋白的单克隆抗体以及配套的检测试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性结合权...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏梦妍，金月翔，
申请(专利权)人：广州庆毅生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：