根腐线虫Pc-CB蛋白、编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了根腐线虫Pc

【技术实现步骤摘要】
根腐线虫Pc
‑
CB蛋白、编码基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及根腐线虫Pc
‑
CB蛋白、编码基因及其应用。

技术介绍

[0002]根腐线虫(Pratylenchus Filipjev,1936)又称短体线虫。咖啡短体线虫(P.coffeae)是最重要的根腐线虫之一，是一种迁移性的植物内寄生病原线虫，寄主十分广泛，常通过口针将体内分泌的不同效应子输送至寄主根系，侵染后会造成寄主地上部植株矮小褪色，地下部根系减少、腐烂变褐甚至坏死等一系列症状。真菌和细菌还会入侵该线虫口针损伤的部位，造成病害复合侵染的现象，导致病害加重，对农业可持续安全生产构成巨大的威胁。咖啡短体线虫可危害小麦、玉米、大豆、芝麻、烟草、番茄、山药等多种粮食和经济作物，对农业生产造成巨大的经济损失咖啡短体线虫广泛分布于全球各地，它对农业生产带来的巨大危害使其备受关注和研究，但因其定殖和适生能力强，防治已成为一个世界性难题，鉴别并研究咖啡短体线虫致病相关基因及其功能是筛选安全有效防治靶标的最新突破点。
[0003]植物寄生线虫功能相关基因主要在食道腺、体表和尾感器等部位表达。在线虫侵染寄主的过程中，常通过口针将一些功能蛋白不断地输送至寄主植物体内来协助其完成寄生，这些蛋白能够帮助线虫操纵并调控寄主植物的防御反应，抑制植物的抗病反应，在线虫取食位点的建立和维持等过程中发挥着重要作用，此类蛋白统称为效应蛋白。高通量基因组测序技术的成熟使得植物寄生线虫功能基因的研究一直在不断的革新发展，有关病原线虫效应蛋白的筛选和功能研究已成为当前植物病理学研究领域的热点，当下许多线虫学者的研究成果使人们对线虫的致病机理有了更加深入的认知。半胱氨酸类蛋白酶在多种线虫及动物寄生虫生命活动中的细胞凋亡、寄生感染、免疫逃避、组织侵袭等生理生化过程中发挥关键功能。但关于根腐线虫组织蛋白酶B(Pc
‑
CB)的研究尚未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供根腐线虫Pc
‑
CB蛋白、编码基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种Pc
‑
CB蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007]本专利技术还提供编码所述Pc
‑
CB蛋白的DNA分子。
[0008]优选的是，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]本专利技术还提供所述DNA分子作为靶标基因在防治咖啡短体线虫中的应用。
[0010]本专利技术还提供所述DNA分子的原位杂交探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0011]本专利技术还提供所述DNA分子的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0012]本专利技术还提供一种防治咖啡短体线虫的产品，所述产品包括所述原位杂交探针、所述dsRNA或包含所述DNA分子的重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、重组菌
或重组基因表达盒。
[0013]优选的是，所述重组表达载体包括双元农杆菌载体、病毒载体、细菌表达载体或酵母表达载体。
[0014]本专利技术还提供一种防治咖啡短体线虫的方法，利用所述的产品沉默所述DNA分子。
[0015]本专利技术通过原位杂交技术、qRT
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PCR、in vitro RNAi技术和农杆菌介导等方法研究了Pc
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CB在根腐线虫侵染致病过程中的功能。
[0016]qPCR能通过荧光信号实时检测整个PCR进程，具有灵敏、精确和快捷等特点。原位杂交作为由组织化学、分子生物学及细胞生物学结合而成的新兴组织定位技术，逐渐成为植物寄生线虫功能研究中最常用的方法。RNAi技术是通过双链诱导基因沉默研究寄生线虫靶基因功能的又一重要方法，它从转录、转录后以及翻译水平途径上阻断靶基因的表达，是目前验证未知功能基因的重要手段之一。咖啡短体线虫作为全球多数作物上的防治难题，筛选并研究咖啡短体线虫新的效应蛋白，明确其在咖啡短体线虫侵染致病等过程中的生物学功能及其与寄主互作的分子机制，将其作为植物源防治靶标的制备，具有重大的使用价值和应用前景。
[0017]本专利技术公开了以下技术效果：
[0018]本专利技术提供咖啡短体线虫食道腺表达基因Pc
‑
CB，它在雌虫的表达量显著高于幼虫、雄虫和卵中表达量(P<0.05)；亚细胞定位结果表明Pc
‑
CB蛋白定位在本氏烟叶片的细胞质和细胞核。本专利技术通过基因沉默，使咖啡短体线虫摄入Pc
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CB dsRNA片段，测定了Pc
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CB基因沉默对咖啡短体线虫的生殖以及对寄主玉米侵染力和致病力的影响，实验结果表明Pc
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CB基因经dsRNA处理沉默后，咖啡短体线虫的繁殖力与对照eGFP dsRNA相比下降了63.3％，线虫对寄主玉米的侵染力和致病力与对照eGFP dsRNA相比也显著下降(P<0.05)，表明Pc
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CB基因可作为靶标基因在防治咖啡短体线虫中的应用。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为实施例中Pc
‑
CB基因在咖啡短体线虫中的组织定位，A:正义链探针无杂交信号(负对照)；B与C:反义链探针杂交信号显示在咖啡短体线虫食道腺细胞中，S：口针；mb：中食道球；eg：食道腺；
[0021]图2为实施例中Pc
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CB基因在咖啡短体线虫4种不同虫态中的表达定量分析，通过qRT
‑
PCR方法进行检测，相对表达分析的方法为2
‑△△
Ct
法，内参基因为eGFP，雌虫的RQ＝l，female：雌虫；juvenile：幼虫；egg：卵；male：雄虫；
[0022]图3为为实施例中Pc
‑
CB的亚细胞定位结果，Pc
‑
CB蛋白定位于烟草叶片细胞的细胞核和细胞质上，A：叠加结果；B：DAPI蓝色荧光下加细胞核marker观察结果；C：GFP绿色荧光下观察结果；D：明场下观察结果；
[0023]图4为实施例中Pc
‑
CB基因的沉默效率检测结果，CK，未处理的线虫；G12,G24,G36和G48：分别为线虫经过eGFP dsRNA处理12、24、36和48h；R12，R24，R36和R48：分别为线虫经
过Pc
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CB dsRNA处理12、24、36和48h；
[0024]图5为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Pc
‑
CB蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.编码权利要求1所述Pc
‑
CB蛋白的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.如权利要求2
‑
3任一项所述DNA分子作为靶标基因在防治咖啡短体线虫中的应用。5.如权利要求2
‑
3任一项所述DNA分子的原位杂交探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。6.如权利要求2
‑
3任一项所述D...

【专利技术属性】
技术研发人员：王珂，李宇，胡瑶君，袁虹霞，李洪连，孙炳剑，李永辉，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：