一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，包括如下步骤：1)蛇毒粉用缓冲液溶解，去沉淀，得清液；2)离子交换层析：用Tris

【技术实现步骤摘要】
一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法


[0001]本专利技术属于提取物制备
，具体是涉及一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法。

技术介绍

[0002]降纤酶通过专一性的激活或灭活作用后，该蛋白酶作用于血液凝固、纤溶系统的各个步骤，产生促凝或抗凝效应，在体外引起血浆纤维蛋白原的凝聚，起凝血作用。在临床上蛇毒类凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性脑梗死，以及脑梗死再复发的预防等。
[0003]降纤酶本身为白色非结晶粉末，有引湿性，易溶于水。有分解血浆纤维蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力作用。
[0004]现有技术降纤酶的制备方法较多，但多因步骤多、时间长、收率低、蛋白构成不稳定导致其活性低，染菌污染的风险较大等缺陷。
[0005]这些分离纯化降纤酶的方法有：1﹚取DEAE
‑
Sephadexa
‑
50(二乙氨基—乙基
‑
葡萄糖凝胶a
‑
50，简称a
‑
50)，加入新鲜蒸馏水，加热煮沸15min，放至室温，加pH7.6的0.05 mol/L Tris
‑
HCl缓冲液搅拌，放置数小时，弃去上清液，再加入上述缓冲液，如此反复数次，测pH为7.6，即达平衡。用上述缓冲液平衡，是因为降纤酶的最适pH为7.4～7.6，且在pH7.6的条件下，a
‑
50稳定。再将蛇毒粗品均匀加在a
‑
50柱中。洗脱条件，第一梯度，在搅拌瓶中加pH7.6，含0.1 mol/L氯化钠的Tris
‑
HCl缓冲液1000 mL；第二梯度，在搅拌瓶中加pH7.6，含0.1 mol/L氯化钠的Tris
‑
HCl缓冲液1000 mL，贮存瓶中pH7.6，含0.1 mol/L氯化钠的Tris
‑
HCl缓冲液1000 mL。共分离出9个峰，将合格峰合并，即得降纤酶。
[0006]2）将尖吻蝮蛇蛇毒20克溶于8.0的缓冲液1000 mL中，上柱，用平衡缓冲液冲洗后再用含0.15 mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集含降纤酶活性成分的溶液。亲和层析填料系用经溴化氰活化，接上二氨基二丙基胺后经琥珀酸化，偶联亲和降纤酶的配基而成。将柱层析收集的洗脱液上亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗后，用含0.2 mol/L盐酸胍的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液，经超滤去盐浓缩，冻干，即得产品。此法从蛇毒20克制得产品69.3毫克，比活2886单位/毫克。
[0007]从以上文献中可以看出，由于蛇毒中降纤酶目标蛋白含量低，杂蛋白干扰大，不管是单一运用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析还是疏水层析，其中哪种都很难纯化到高纯度的降纤酶目标蛋白。另一方面，降纤酶稳定性差，不选择恰当的缓冲液和贮藏条件，即使分离到高纯度目标蛋白，也会很快降解，文献中公开的工艺很难应用于产业化，所以开发一种纯度高、稳定性好能运用于大规模生产的降纤酶工艺成为一种迫切需求。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题是提供一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，纯度高，活性高，稳定性好。
[0009]本专利技术的内容包括一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，包括如下步骤：1)蛇毒粉用缓冲液溶解，去沉淀（优选为超滤离心，超滤离心为使用超滤孔径大小为50 KD的超滤膜），得清液；2)离子交换层析：用Tris
‑
HCl缓冲液（Tris
‑
HCl缓冲液也可以含有NaCl）平衡层析柱，将上述清液上柱，用Tris
‑
HCl缓冲液和含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集酶活性部分，超滤浓缩，得浓缩液；3)亲和层析：用含NaCl的NaAc缓冲液平衡亲和层析柱，将上述步骤2）得到的浓缩液上柱，用含不同浓度NaCl的NaAc缓冲液进行梯度洗脱，收集酶活性部分，超滤浓缩，得浓缩液；4)凝胶过滤层析：用含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液平衡凝胶柱，将上述步骤3）得到的浓缩液上样于凝胶柱，用含不同浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集酶活性部分，超滤浓缩，得降纤酶。
[0010]优选的，所述步骤2）的梯度洗脱的程序为用Tris
‑
HCl缓冲液和含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液和Tris
‑
HCl缓冲液的梯度为10~100%，流程：2800 mL。即在最开始时，含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液和Tris
‑
HCl缓冲液的体积比为10:90，即前者占比10%，后者占比90%；然后随着时间的推移，前者体积逐渐升高到100%，后者体积逐渐减少到0%。
[0011]优选的，所述步骤3）的梯度洗脱的程序为用两种含不同浓度的NaCl的NaAc缓冲液进行梯度洗脱，含大浓度NaCl的NaAc缓冲液和含小浓度NaCl的NaAc缓冲液的梯度为25~100%，流程：2500 mL。即在最开始时，含大浓度NaCl的NaAc缓冲液和含小浓度NaCl的NaAc缓冲液的体积比为25:75，即前者占比25%，后者占比75%；然后随着时间的推移，前者体积逐渐升高到100%，后者体积逐渐减少到0%。
[0012]优选的，所述步骤4）的梯度洗脱的程序为用两种含不同浓度的NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，含大浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液和含小浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液的梯度为20~100%，流程：1000 mL。即在最开始时，含大浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液和含小浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液的体积比为20:80，即前者占比20%，后者占比80%；然后随着时间的推移，前者体积逐渐升高到100%，后者体积逐渐减少到0%。
[0013]优选的，所述步骤2）的平衡层析柱的Tris
‑
HCl缓冲液的pH值为7～9，所述步骤3）的平衡亲和层析柱的含NaCl的NaAc缓冲液的pH值为5～7，所述步骤4）的平衡凝胶柱的含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液的pH值为7～9。
[0014]优选的，所述步骤2）的平衡层析柱的Tris
‑
HCl缓冲液的pH值为7.8，所述步骤3）的平衡亲和层析柱的含NaCl的NaAc缓冲液的pH值为5.5，所述步骤4）的平衡凝胶柱的含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液的pH值为7.5。
[0015]优选的，所述步骤1)中所述的缓冲液为pH7～9（优选为7.8）的Tris
‑
HCl缓冲液或者为pH 7～9的含有NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0016]优选的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，其特征是，包括如下步骤：1)蛇毒粉用缓冲液溶解，去沉淀，得清液；2)离子交换层析：用Tris
‑
HCl缓冲液平衡层析柱，将上述清液上柱，用Tris
‑
HCl缓冲液和含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集酶活性部分，超滤浓缩，得浓缩液；3)亲和层析：用含NaCl的NaAc缓冲液平衡亲和层析柱，将上述步骤2）得到的浓缩液上柱，用含不同浓度NaCl的NaAc缓冲液进行梯度洗脱，收集酶活性部分，超滤浓缩，得浓缩液；4)凝胶过滤层析：用含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液平衡凝胶柱，将上述步骤3）得到的浓缩液上样于凝胶柱，用含不同浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集酶活性部分，超滤浓缩，得降纤酶。2.如权利要求1所述的从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，其特征是，所述步骤2）的梯度洗脱的程序为用Tris
‑
HCl缓冲液和含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液和Tris
‑
HCl缓冲液的梯度为10~100%。3.如权利要求1所述的从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，其特征是，所述步骤3）的梯度洗脱的程序为用两种含不同浓度的NaCl的NaAc缓冲液进行梯度洗脱，含大浓度NaCl的NaAc缓冲液和含小浓度NaCl的NaAc缓冲液的梯度为25~100%。4.如权利要求1所述的从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，其特征是，所述步骤4）的梯度洗脱的程序为用两种含不同浓度的NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液进行梯度洗脱，含大浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液和含小浓度NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液的梯度为20~100%。5.如权利要求1所述的从蛇毒粉中提取降纤酶的方法，其特征是，所述步骤2）的平衡层析柱的Tr...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘达，刘杨，刘选，李多娇，杨世平，蔡小涛，李波，向岳辉，刘坤，康璐，刘雄杰，陈达，张静，刘娟，
申请(专利权)人：康普药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：