本发明专利技术涉及一种凝血因子IX突变体及其应用，对应于野生型凝血因子IX氨基酸序列中340位置的氨基酸并非谷氨酸，而是赖氨酸或者精氨酸，如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术证实凝血因子IX突变体Glu340Lys或Glu340Arg可以提升凝血因子IX活性，而且还可以与其他突变体协同提升凝血因子IX活性，具有很好的基因治疗和替代治疗前景。治疗和替代治疗前景。治疗和替代治疗前景。
【技术实现步骤摘要】
25,pp.18477
–
18486,1999]以及专利WO 99/03496中描述了通过人工诱导突变构建的凝血因子IX突变Arg384Ala(或成熟FIX蛋白编码Arg338Ala)，其活性水平比野生型FIX中发现的活性水平高2
‑
3倍。2009年在意大利的padua的一个血栓性疾病的患者中发现一种突变的凝血因子IX蛋白，Arg384Leu(或成熟FIX蛋白编码Arg338Leu)，它的活性是正常人的7～9倍[X
‑
Linked Thrombophilia with aMutant Factor IX(Factor IX Padua),Paolo Simioni,The new england journal of medicine]。随后的研究就把这种突变基因通过腺相关病毒载体(AAV)用于基因治疗(PCT/EP2009/061935)，临床试验获得了非常好的效果，病人的凝血因子IX水平达到了正常的20％左右。384位氨基酸突变Arg384Asp和Arg384Gln也可以使凝血因子IX活性升高，其中Arg384Asp高4～5倍。Wenman Wu等在中国血栓患者中也发现了Arg384Gln突变，其可以使凝血因子IX的活性升高5～7倍以上。目前认为Arg384位点功能获得性突变使凝血因子IX对其生理底物即FX的蛋白酶活性增加，或与FVIIIa(FIXa的辅因子相互作用的能力增加，从而提升凝血因子IX促凝活性。因为Arg384Leu和Arg384Gln突变是在血栓患者中所发现，除了形成血栓外，没有造成其他疾患，也没产生抗体，没有安全隐患，最终被用于临床的基因治疗。
[0006]以上研究和发现显示虽然绝大多数凝血因子IX编码基因突变都是导致的功能缺陷，但是极其罕见的在特定位点的特定类型突变可以是功能获得性的，可以使凝血因子IX活性提升。这些功能获得性的突变体可以应用制备蛋白、核酸和基因治疗类药物治疗出血性疾病。
技术实现思路
[0007]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种凝血因子IX突变体及其应用，该凝血因子IX突变体Glu340Lys或Glu340Arg可以提升凝血因子IX活性，而且还可以与其他突变体协同提升凝血因子IX活性，具有很好的基因治疗和替代治疗前景。
[0008]本专利技术提供了一种凝血因子IX突变体，对应于野生型凝血因子IX氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)中340位置的氨基酸并非谷氨酸(Glutamate，Glu，E)，而是赖氨酸(Lysine，Lys，K)或者精氨酸(Arginine，Arg，R)，如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
[0009]本专利技术提供了一种凝血因子IX的突变蛋白，与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列具有至少70％的同源性。
[0010]本文所指两个氨基酸或核苷酸序列之间的“百分比同源性”和“％同源性”是指两个最佳比对序列中相应位置的同源氨基酸或核苷酸残基的百分比。核酸和氨基酸比对可采用NCBI的BLAST程序实施确定。
[0011]编码凝血因子IX的突变蛋白的核酸，对应于1044、1045和1046的位置并非野生型凝血因子IX核酸序列的三联体GAA(如SEQ ID NO:4所示)，而是以下三联体中的一种：AAA、AAG，如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。
[0012]编码凝血因子IX的突变蛋白的核酸，对应于1044、1045和1046的位置并非野生型凝血因子IX核酸序列的三联体GAA，而是以下三联体中的一种：CGT、CGA、CGC、CGG、AGA和AGG，如SEQ ID NO:7
‑
12任一所示。
[0013]凝血因子IX的突变蛋白的核酸，或与所述编码核酸长度相同且与所述编码核酸完全互补的核酸，与SEQ ID NO:5
‑
12任一的核酸序列具有至少70％的同源性。
[0014]所述的核酸，包含与所述核酸可操作连接的启动子。
[0015]所述的核酸，包含核酸的表达载体。
[0016]本专利技术还提供了一种生产凝血因子IX的突变蛋白的方法，其中凝血因子IX的突变蛋白通过所述的核酸表达。
[0017]所述方法包括以下步骤：将表达载体引入细胞；培养细胞以表达凝血因子IX的突变蛋白。
[0018]优选的，本专利技术还提供了凝血因子IX的突变蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0019](1)将含有人凝血因子IX E340K或E340R突变或其他上文描述的FIX变体的人凝血因子IX基因连入载体中，得到重组载体；
[0020](2)将上述重组载体转化宿主细胞，得到重组细胞克隆；
[0021](3)于无血清培养基中连续灌流培养上述重组细胞克隆，诱导重组凝血因子IX的突变蛋白的表达；
[0022](4)分离纯化、过滤，最后灌装、冻干，得到所表达的凝血因子IX的突变蛋白。
[0023]所述步骤(3)中的无血清培养基为“SAFC Biosciences EX
‑
CELL
TM 302”(商品化的试剂)。
[0024]所述步骤(4)中的纯化包括初纯和精纯。
[0025]本专利技术提供了一种凝血因子IX的突变蛋白作为制备至少一种出血性疾病的药物的用途。
[0026]如编码凝血因子IX突变蛋白的核酸作为制备至少一种出血性疾病的药物的用途。
[0027]本专利技术提供了一种核酸的应用，应用于制备基因治疗药物。
[0028]所述基因治疗药物的载体为病毒载体或非病毒载体。
[0029]所述病毒载体为腺相关病毒、腺病毒、慢病毒中的一种。
[0030]本专利技术提供了一种核酸的应用，应用于制备mRNA药物。
[0031]本专利技术提供了一种凝血因子IX的突变蛋白的应用，应用于制备凝血因子IX突变体融合蛋白，并将其施用于血友病B或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。
[0032]所述融合蛋白为人白蛋白、免疫球蛋白Fc、转铁蛋白或alpha 1抗胰蛋白酶。
[0033]本专利技术还提供了一种凝血因子IX突变体应用于和其他凝血因子IX突变体的联合使用。
[0034]优选的，本专利技术还提供了另外一种凝血因子IX突变体，包括凝血因子IX突变体和凝血因子IX Arg384Gln或凝血因子IX Arg384Leu，如SEQ ID NO:13
‑
16任一所示。
[0035]本专利技术还提供另外一种凝血因子IX的突变蛋白，与SEQ ID NO:13
‑
16任一序列具有至少70％的同源性。
[0036]编码凝血因子IX的突变蛋白的核酸，对应于1044、1045和1046的位置并非野生型凝血因子IX核酸序列的三联体GAA，而是以下三联体中的一种：AAA，AAG，CGT，CGA，CGC，CGG，AGA，AGG；对应于1176、1177和1178的位置并非野生型凝血因子IX核酸序列的三联体CG本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种凝血因子IX突变体，其特征在于：对应于野生型凝血因子IX氨基酸序列中340位置的氨基酸并非谷氨酸，而是赖氨酸或者精氨酸，如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。2.一种凝血因子IX的突变蛋白，与如权利要求1所述的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列具有至少70％的同源性。3.编码如权利要求2所述的凝血因子IX的突变蛋白的核酸，其特征在于：对应于1044、1045和1046的位置并非野生型凝血因子IX核酸序列的三联体GAA，而是以下三联体中的一种：AAA、AAG，如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。4.编码如权利要求2所述的凝血因子IX的突变蛋白的核酸，其特征在于：对应于1044、1045和1046的位置并非野生型凝血因子IX核酸序列的三联体GAA，而是以下三联体中的一种：CGT、CGA、CGC、CGG、AGA和AGG，如SEQ ID NO:7
‑
12任一所示。5.如权利要求2所述的凝血因子IX的突变蛋白的核酸，或与所述编码核酸长度相同且与所述编码核酸完全互补的核酸，与SEQ ID NO:5
‑
12任一的核酸序列具有至少70％的同源性。6.如权利要求3
‑
5任一所述的核酸，包含与所述核酸可操作连接的启动子。7.包含如权利要求6所述的核酸的表达载体。8.一种生产凝血因子IX的突变蛋白的方法，其中凝血因子IX的突变蛋白通过权利要求3
‑
5任一所述的核酸表达。9.如权利要求8所述的方法，包括以下步骤：将如权利要求7所述的表达载体引入细胞；培养细胞以表达凝血因子IX的突变蛋白。10.如权利要求2所述的突变蛋白作为制备至少一种出血性疾病的药物的用途。11.如权利要求3
‑
5任一所述的核酸作为制备至少一种出血性疾病的药物的用途。12.一种如权利要求3
‑
5任一所述的核酸的应用，其特征在于：应用于制备基因治疗药物。13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述基因治疗药物的载体为病毒载体或非病毒载体。14.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：武文漫，王学锋，戴菁，丁秋兰，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。