一种用原核生物高效表达TMPRSS的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开提供了一种适用于原核生物高效可溶性表达人跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2的方法。即通过将一种源自抗冻蛋白的人工肽XXA与TMPRSS2的N端相连形成重组蛋白。人工肽XXA能有效促进TMPRSS2的正确折叠，极大的提高可溶性TMPRSS2的产量，重组蛋白显示出与其原生对应物相同的酶学性质，且比原生对应物的热稳定性更好，本发明专利技术可大幅缩短TMPRSS2的生产周期，降低蛋白纯化成本，提高生产效率，因此具有很广泛的应用价值。因此具有很广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用原核生物高效表达TMPRSS的方法


[0001]本专利技术涉及重组蛋白表达
，具体涉及利用原核蛋白表达系统高效制备人跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)的方法。

技术介绍

[0002]TMPRSS2是一种人体细胞表达的跨膜丝氨酸蛋白酶，全长由492个氨基酸组成，其编码基因位于21号染色体(21q22.3)(Paoloni
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Giacobino,A.,Chen,H.,Peitsch,M.C.,Rossier,C.,and Antonarakis,S.E.(1997).Cloning of the TMPRSS2 gene,which encodes a novel serine protease with transmembrane,LDLRA,and SRCR domains and maps to 21q22.3.Genomics 44,309
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320.)。TMPRSS2在前列腺、肝脏和肺等多个人体器官中都有表达，其原本的生理学功能与消化、炎症反应、肿瘤细胞侵袭等相关。SARS
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CoV
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2与SARS
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CoV属于同一冠状病毒家族，两种病毒以相似的方式感染靶细胞：病毒的spike(S)蛋白与细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，刺激病毒脂质包膜与细胞膜的融合。最新的研究显示TMPRSS2参与了包括SARS
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CoV
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2在内的多种病毒的细胞侵染过程。当SARS/>‑
CoV
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2病毒颗粒接触受体细胞时，病毒颗粒表面刺突蛋白(S蛋白)与受体细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ACE2)相结合，刺激病毒脂质包膜与细胞膜的融合。在启动膜融合之前S蛋白需要被激活，暴露S蛋白的膜融合域，这是一个蛋白水解裂解过程。Furin和TMPRSS2是执行蛋白水解裂解和启动S蛋白的酶。在此过程中，Furin切割S蛋白释放S1和S2亚基，TMPRSS2进一步在S2'位点切割S2亚基，触发膜融合域疏水肽(FP)的暴露，最终在S2亚基介导完成下游的病毒与受体细胞的膜融合过程。由于S蛋白的水解作用对于S2亚基末端疏水氨基酸结构域的释放和细胞膜的嵌入很重要，因此，TMPRSS2介导水解切割过程被称之为S蛋白的激活过程。在没有TMPRSS2的激活作用时，SARS
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CoV、MERS
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CoV和SARS
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CoV
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2等多种病毒的细胞侵染效率、致病率、传染率都大大降低。
[0003]同时，有研究表明TMPRSS2的基因敲除(Kim,T.S.,Heinlein,C.,Hackman,R.C.,and Nelson,P.S.(2006).Phenotypic analysis of mice lacking the Tmprss2
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encoded protease.Mol Cell Biol 26,965
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975.)不会造成小鼠的任何生理学表型的改变，由此，TMPRSS2被认为是一种蛋白冗余。以上证据表明，受体细胞表面蛋白TMPRSS2是影响新冠病毒传播的一个决定性因子。由于该蛋白的功能缺失对机体无明显副作用，因此针对TMPRSS2开发抑制剂可以成为对抗SARS
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CoV
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2的一种有效策略。高纯度有活性的TMPRSS2对于基础研究和药物开发具有很重要的作用。目前，有活性的TMPRSS2主要是由酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等真核细胞表达获得。与真核表达系统相比，利用原核蛋白表达系统例如E.coli表达蛋白具有表达量高、成本低、时间短等优点。然而，目前报道显示TMPRSS2在原核系统中主要以不可溶的包涵体的形式表达，从包涵体中复性蛋白是一个复杂且费时的过程。因此，克服TMPRSS2包涵体问题，有效提高TMPRSS2的可溶性对于大量生产TMPRSS2具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的专利技术目的在于提供一种在大肠杆菌中高效表达可溶性重组蛋白TMPRSS2的方法，该方法能够有效克服TMPRSS2在原核表达系统中不可溶的问题。
[0005]本专利技术提供一种适用原核表达的融合肽，其由人工合成肽XXA与TMPRSS2蛋白融合得到融合蛋白；所述人工合成肽XXA的编码基因(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)如下。
[0006]其中XXA标签的基因序列如下(SEQ ID NO：1)：
[0007]TGGCCGAAACTGCGTGATGCGGCGGATCAAGCGGCAAAAAGCGCGGATGGTGCGCTGGATGAAGGTAAAGCGCAAGCGCGTGGCTTAGGTGAAAAAGCGGATGGCAAACTGGAAAGCTATAAGGAAAAAGCGACCGATGCGGTGGATGAAGCACATCGCCGTGCAGAAGATACTGCGGGTGCAGGTGAAGCAGGTAAATTGGGCGAACGTGCAGCAGGTCAAGCGGATCGTGGTGCGGGTGAAGCGGGTGGTGCGGCAGATCGTGTTGCACGTGAAGCGAGCGGTGGTTTAGAAAGCGCGACCAGCAAAGCAGGTGAAGCGGCAGAAAGTGCGCGTCAAAAAGCGAGCGAATATGCGGAACAGGCGGCGGCAAAAGTTGATGGCCTGACCGATGCGGCAAAACAGGAAGCGTATGGCCTGAATCAGCGCCAAGATCAGACCGTTGATCGTGCGACCGAACAAGTTGATGCGGCGGCGGGTACCGTTACCGAAAAAGTGAAACAGGCGGCGGATAGCGTTGCACATAAAGCGACCGAAATTGCGAGCAAAGCGAAAGAT。
[0008]XXA标签的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：2)：
[0009]WPKLRDAADQAAKSADGALDEGKAQARGLGEKADGKLESYKEKATDAVDEAHRRAEDTAGAGEAGKLGERAAGQADRGAGEAGGAADRVAREASGGLESATSKAGEAAESARQKASEYAEQAAAKVDGLTDAAKQEAYGLNQRQDQTVDRATEQVDAAAGTVTEKVKQAADSVAHKATEIASKAKDALSEDQWMDYKDDDD。
[0010]所述TMPRSS2的编码基因(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列由SEQ ID NO：(SEQ ID NO：4)如下：
[0011]其中TMPRSS2的基因序列如下(SEQ ID NO：3)：
[0012]TGGAAATTTATGGGCAGCAAATGCAGCAACAGCGGCATTGAATGCGATAGCAGCGGCACCTGCATTAACCCGAGCAACTGGTGCGATGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用原核表达的融合肽，其特征在于，由人工合成肽XXA与人跨膜丝氨酸蛋白酶2融合得到融合蛋白；所述人工合成肽XXA由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码。2.如权利要求2所述的融合肽，其特征在于，所述融合蛋白还包括纯化标签，如His标签。3.如权利要求1或2所述的融合肽，其特征在于，在人工合成肽XXA与蛋白人跨膜丝氨酸蛋白酶2之间还设置有蛋白酶切位点；优选地，所述蛋白酶切位点为3C蛋白酶切割位点，所述蛋白酶为3C蛋白酶。4.如权利要求1至3任一项所述的融合肽的编码核苷酸。5.含有如权利要求1至3任一项所述的融合肽的编码核苷酸的重组表达载体，优选为原核生物表达载体，更优选为大肠杆菌表达载体。6.含有如权利要求5所述的重组表达载体的原核宿主细胞，优选为大肠杆菌宿主细胞。7.一种在原核生物中高效表...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶朗，叶晓，凌雪，武敏，白桂杰，袁梦，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：