一种产肝素前体的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种产肝素前体的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术采用的技术方案是敲除脂多糖（LPS）合成基因waaJ和克拉酸合成基因簇wca，阻断LPS和CA合成，从而使更多的碳源进入肝素前体合成途径，提高肝素前体产量和/或转化率。本发明专利技术进一步增强肝素前体合成酶KfiA（UDP‑GlcNAc糖基转移酶）和KfiC（UDP‑GlcA糖基转移酶）以及KfiD（UDP‑葡萄糖脱氢酶，催化UDP‑Glc生成UDP‑GlcA）的表达，可进一步提高肝素前体产量和/或转化率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，具体涉及一种产肝素前体的基因工程菌及其应用。

技术介绍

1、肝素是硫酸化糖胺聚糖，在临床上作为抗凝血药物广泛应用，目前主要从猪肠黏膜中提取生产，存在污染和掺假的潜在风险。2008年美国发生的肝素污染事件使得肝素的安全生产备受关注。利用微生物生产的肝素前体制备生物工程肝素，为动物源肝素提供了一种潜在的更安全的替代品。

2、肝素前体(又称肝素原，heparosan)是一种天然酸性多糖，由重复二糖单元d-葡萄糖醛酸(glca)和n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)组成，在大肠杆菌k5(escherichia colik5)、多杀巴斯德菌(pasteurella multocida)、大肠杆菌nissle 1917(escherichiacolinissle 1917,简称ecn)等细菌中天然存在。为了生产肝素前体，已报道了通过发酵优化，大肠杆菌k5产量达15g/l(e.coli k5fermentationand the preparation ofheparosan,a bioengineered heparin precu本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种产肝素前体的基因工程菌，其特征在于，以能够合成肝素前体的菌株作为出发菌，敲除或降低脂多糖合成基因waaJ和/或克拉酸合成基因簇wca的表达。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述敲除或降低克拉酸合成基因簇wca的表达，是指敲除或降低克拉酸合成基因簇wca17个基因中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个或全部的表达，所述17个基因为：wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM；

3.如权利要求1至2任一项所述的基因工程菌，...

【技术特征摘要】

1.一种产肝素前体的基因工程菌，其特征在于，以能够合成肝素前体的菌株作为出发菌，敲除或降低脂多糖合成基因waaj和/或克拉酸合成基因簇wca的表达。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述敲除或降低克拉酸合成基因簇wca的表达，是指敲除或降低克拉酸合成基因簇wca17个基因中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个或全部的表达，所述17个基因为：wcaa，wcab，wcac，wcad，wcae，wcaf，gmd，wcag，wcah，wcai，manc，manb，wcaj，wzx，wcak，wcal，wcam；

3.如权利要求1至2任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌是具有天然肝素前体合成途径的菌株，或在udp-glca和udp-glcnac合成途径基础上，再导入外源kfiac或pmhs1或pmhs2的菌株；优选地，所述出发菌为大肠杆菌、多杀巴斯德菌、芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌；更优选地，出发菌为大肠杆菌k5、大肠杆菌nissle 1917、大肠杆菌k12、大肠杆菌bl21、大肠杆菌w3110、大肠杆菌mg1655。

4.如权利要求1至3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还包括增强肝素前体合成酶kfia、kfic和kfid中一个、两个或三个基因的表达，或包括增强肝素前体合成酶pmhs1和/或pmhs2的表达；优选地，所述肝素前体合成酶kfia、kfic和kfid来源于大肠杆菌ecn或大肠杆菌k5，pmhs1或pmhs2来...

【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，李金山，殷亮，王嘉莹，杨书尧，寇梦云，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：