一种减少副产物并提高肝素前体产量的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种减少副产物并提高产肝素前体的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术采用的技术方案是敲除乙酸合成途径基因ackA和poxB，乳酸合成途径基因ldhA，阻断乙酸和乳酸合成，从而使更多的碳代谢流进入肝素前体合成途径，提高肝素前体产量、转化率和/或降低副产物。本发明专利技术进一步增强肝素前体合成酶KfiA（UDP‑GlcNAc糖基转移酶）和KfiC（UDP‑GlcA糖基转移酶）以及KfiD（UDP‑葡萄糖脱氢酶，催化UDP‑Glc生成UDP‑GlcA）的表达，可进一步提高肝素前体产量、转化率和/或降低副产物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，具体涉及一种减少副产物并提高肝素前体产量的基因工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

1、肝素是一种高度硫酸化、异构的线性糖胺聚糖，主要从猪肠粘膜和牛肺中分离出来，由动物结缔组织中的肥大细胞产生。由于肝素良好的抗凝血作用，成为临床抗凝血常见的药物之一，临床主要应用于预防及治疗静脉栓塞、心血管手术、血液透析等。然而，肝素生产的局限性在于它依赖于单一的动物物种，并且动物来源的肝素存在潜在安全问题。2008年的污染危机促使人们寻找新的动物来源，利用微生物生产的肝素前体经系列酶催化制备生物工程肝素，有望成为从非动物来源生产肝素的替代方法。

2、肝素前体(又称肝素原，heparosan)是一种天然酸性多糖，由重复二糖单元d-葡萄糖醛酸(glca)和n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)组成，在大肠杆菌k5(escherichia colik5)、多杀巴斯德菌(pasteurella multocida)、大肠杆菌nissle 1917(escherichiacolinissle 1917,简称ecn)等细菌中天然存在。为了生产肝素前体本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种产肝素前体的基因工程菌，其特征在于，以能够合成肝素前体的菌株作为出发菌，敲除或降低乙酸激酶编码基因ackA或丙酮酸氧化酶编码基因poxB的表达；或者敲除或降低乙酸激酶编码基因ackA、丙酮酸氧化酶编码基因poxB与乳酸脱氢酶编码基因ldhA中两个或三个基因的表达。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除或降低的基因或基因组合是：乙酸激酶编码基因ackA，或者丙酮酸氧化酶编码基因poxB，或者乙酸激酶编码基因ackA和乳酸脱氢酶编码基因ldhA，或者乙酸激酶编码基因ackA和丙酮酸氧化酶编码基因poxB，或者乳酸脱氢酶编码基因ldhA和丙酮酸氧...

【技术特征摘要】

1.一种产肝素前体的基因工程菌，其特征在于，以能够合成肝素前体的菌株作为出发菌，敲除或降低乙酸激酶编码基因acka或丙酮酸氧化酶编码基因poxb的表达；或者敲除或降低乙酸激酶编码基因acka、丙酮酸氧化酶编码基因poxb与乳酸脱氢酶编码基因ldha中两个或三个基因的表达。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除或降低的基因或基因组合是：乙酸激酶编码基因acka，或者丙酮酸氧化酶编码基因poxb，或者乙酸激酶编码基因acka和乳酸脱氢酶编码基因ldha，或者乙酸激酶编码基因acka和丙酮酸氧化酶编码基因poxb，或者乳酸脱氢酶编码基因ldha和丙酮酸氧化酶编码基因poxb，或者乙酸激酶编码基因acka和乳酸脱氢酶编码基因ldha和和丙酮酸氧化酶编码基因poxb。

3.如权利要求1至2任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌是具有天然肝素前体合成途径的菌株，或在udp-glca和udp-glcnac合成途径基础上，再导入外源kfiac或pmhs1或pmhs2的菌株；优选地，所述出发菌为大肠杆菌、多杀巴斯德菌、芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌；更优选地，所述出发菌为大肠杆菌k5、大肠杆菌nissle 1917、大肠杆菌k12、大肠杆菌bl21、大肠杆菌w3110、大肠杆菌mg1655。

4.如权利要求1至3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还包括增强肝素前体合成酶kfia、kfic和kfid中一个、两个或三个基因的表达，或包括增强肝素前体合成酶pmhs1和/或pmhs2的表达；优选地，所述肝素前体合成酶kfia、kfic和kfid来源于大肠杆菌ecn...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金山，殷亮，马延和，杨书尧，寇梦云，王嘉莹，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：