MBP标签、Spy标签或MBP-Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用制造技术

本发明专利技术公开了MBP标签、Spy标签或MBP

【技术实现步骤摘要】
MBP标签、Spy标签或MBP
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Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用


[0001]本专利技术涉及MBP标签、Spy标签或MBP
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Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用，属于蛋白表达


技术介绍

[0002]胶原蛋白(Collagen)是细胞外基质的主要成分，约占动物体内蛋白质总量的25
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30％，它广泛存在于动物的结缔组织中，对机体和脏器起着支持、保护等作用。目前，重组胶原蛋白已成为该领域的热点，不仅能够在短时间内获得大量基因表达产物，而且所需成本也相对低廉。然而原核表达的重组胶原蛋白缺乏翻译后加工，导致不正确的蛋白折叠形成不溶性包涵体，需要经过后续复杂的工艺处理才能提高蛋白产量及纯度，不仅使成本增加，还使蛋白产量损耗增多。为了表达大量的可溶性外源蛋白，促溶标签常被用于促进外源重组蛋白的可溶性表达。
[0003]麦芽糖结合蛋白(MBP)标记的重组蛋白可以减轻毒性，提高表达量和溶解度，然而，MBP的分子量太大(42KDa)，当MBP标签被移除时，可能会导致目标蛋白的不溶或聚集；而促溶标签Spy是细菌周质伴侣，是一种具有摇篮形表面的二聚体，利用疏水和静电力与其底物相互作用，抑制蛋白质聚集并协助蛋白质折叠或重新折叠，此外还能促进不同重组蛋白的溶解度，提高靶蛋白的稳定性及产量。因此，利用MBP标签、Spy标签或MBP
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Spy串联标签不仅可以增加重组蛋白的溶解性，还能协助蛋白的折叠以及提高蛋白的表达量。

技术实现思路
r/>[0004]本专利技术的目的是利用促溶标签来提高重组蛋白的表达和溶解。
[0005]本专利技术采用的技术方案：
[0006]MBP标签或Spy标签在辅助重组蛋白表达中的应用。
[0007]本专利技术还公开了一种MBP
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Spy串联标签，由MBP标签与Spy标签串联而成。
[0008]优选的，所述MBP标签与Spy标签之间通过Linker1连接。
[0009]优选的，所述Linker1的氨基酸序列为GSGGGS。
[0010]上述的串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用。
[0011]本专利技术还公开了一种重组蛋白，为在蛋白的N端连接标签而成，所述标签为MBP标签或Spy标签，或者上述的MBP
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Spy串联标签。
[0012]优选的，所述蛋白为胶原蛋白或纤连蛋白。
[0013]优选的，所述标签与蛋白之间通过Linker2连接，所述Linker2为(EAAAK)3。
[0014]优选的，所述Linker2与蛋白之间还设有TEV蛋白酶裂解序列ENLYFQG。
[0015]本专利技术还公开了上述的重组蛋白的编码基因。
[0016]本专利技术还公开了上述的重组蛋白的表达载体。
[0017]优选的，所述载体为pSEVA321。
[0018]本专利技术还公开了上述的重组蛋白的表达宿主菌。
[0019]优选的，所述宿主菌为大肠杆菌。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术使用Spy标签或MBP标签来促进重组蛋白的溶解性，协助蛋白进行正确折叠，且有助于提高蛋白的表达量。其中MBP
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Spy串联标签的效果明显优于单独的Spy标签或MBP标签。
附图说明
[0022]图1为pSEVA321
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His6‑
MBP
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Spy
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Col1的质粒图谱。
具体实施方式
[0023]以下通过实施例进一步说明本专利技术，但不作为对本专利技术的限制。以下提供了本专利技术实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本专利技术，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024]实施例1：单一标签融合蛋白的制备
[0025]1.质粒构建
[0026](1)pSEVA321
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Spy和pSEVA321
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MBP表达载体构建
[0027]根据蛋白质序列委托生工生物公司合成Spy与MBP基因序列，其中促溶标签Spy的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；促溶标签MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过Snapgene软件设计引物，以PCR技术扩增出Spy与MBP的基因片段后回收PCR产物，并利用同源臂引物，采用Gibson连接技术将Spy基因与MBP序列连接到载体上构建表达载体pSEVA321
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Spy和pSEVA321
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MBP。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，以氯霉抗性筛选阳性转化子，挑选转化子进行琼脂凝胶电泳验证，选择阳性转化子进行测序验证及质粒抽提。
[0028]PCR扩增：
[0029]体系成分成分体积引物F2.5μL引物R2.5μLQ5 High
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Fidelity 2x Master Mix2μL模板DNA25μLddH2OTo 50μL
[0030]配制完PCR体系后，混匀并离心，PCR扩增条件为：第一阶段98℃预变性30s；第二阶段98℃变性10s，50
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72℃退火30s，72℃延伸30s/kb，32个循环次数；第三阶段72℃终延伸2min。使用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因片段，按照产品说明书的操作步骤进行。
[0031]Gibson连接：
[0032]体系成分成分体积
Gibson Assembly Master Mix(2X)5μL连接片段0.2
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1pmols*XμLdd H2O(5
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X)μL总体系10μL
[0033]将以上成分在冰上混匀之后置于37℃热浴60min，获得的连接产物储存在冰上或者
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20℃，以便后续的感受态转化。
[0034]转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：在冰上缓慢融解感受态细菌(对于新鲜制备的感受态可以直接使用)，加入3
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5ul连接产物，轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒连接产物，冰浴放置30min，结束后42℃水浴热激2min,加入500ul LB，于37℃、220rpm恒温摇床培养1小时，培养后2000
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3000g离心1min使菌体沉淀，留下约50
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100ul上清重悬沉淀，然后全部涂布到含有氨苄素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
[0035](2)pSEVA321
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His6‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.MBP标签或Spy标签在辅助重组蛋白表达中的应用。2.一种MBP
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Spy串联标签，其特征在于由MBP标签与Spy标签串联而成。3.根据权利要求2所述的MBP
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Spy串联标签，其特征在于所述MBP标签与Spy标签之间通过Linker1连接。4.根据权利要求3所述的MBP
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Spy串联标签，其特征在于所述Linker1的氨基酸序列为GSGGGS。5.权利要求2
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4中任一项所述的MBP
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Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用。6.一种重组蛋白，其特征在于：为在蛋白的N端连接标签而成，所述标签为MBP标签或Spy标签，或者权利要求2
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4中任一项所述的MBP
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【专利技术属性】
技术研发人员：田江杰，王晶晶，张丽娟，
申请(专利权)人：广州普言生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：